布洛芬调控IKKβ/IκBα/NF-κB信号通路对肝癌细胞株增殖及凋亡的影响

南振华 潘灵辉 张维康

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院麻醉科

布洛芬调控IKKβ/IκBα/NF-κB信号通路对肝癌细胞株增殖及凋亡的影响

南振华 潘灵辉 张维康

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院麻醉科

目的 探讨布洛芬调控IKKβ/IκBα/NF-κB信号通路对肝癌细胞增殖及凋亡的影响。方法 选择人肝癌QGY-7703细胞为研究对象，采用随机数字表法将QGY-7703细胞随机分为对照组（Qc组）和不同浓度布洛芬组，每组6例：Q1组（布洛芬作用浓度为250μmol/L）、Q2组（布洛芬作用浓度为500μmol/L）、Q3组（布洛芬作用浓度为1 000μmol/L）、Qc组加入等容量的RPM I-l640培养基。各组分别孵育24 h、48 h和72 h时，采用CCK-8法测定不同浓度及不同孵育时间细胞的增殖抑制情况，流式细胞术检测细胞凋亡情况；孵育48 h时，采用实时荧光定量PCR和Western blot检测各组细胞中IKKβ和Bcl-2基因mRNA和蛋白的变化以及磷酸化IKKβ（p-IKKβ）、磷酸化IκBα（p-IκBα）、NF-κBp65蛋白的表达情况。结果 与Qc组比较，Q1组、Q2组、Q3组细胞增殖抑制率及细胞凋亡率均增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；Q1组、Q2组、Q3组细胞增殖抑制率及细胞凋亡率依照布洛芬作用浓度和时间的增加而依次增加，具有浓度和时间依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Qc组比较，Q1组、Q2组、Q3组细胞IKKβmRNA和Bcl-2mRNA表达明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；Q1组、Q2组、Q3组比较，细胞IKKβmRNA和Bcl-2 mRNA表达依照布洛芬作用浓度的增加而依次下调，具有浓度依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Qc组比较，Q1组、Q2组、Q3组细胞IKKβ、Bcl-2、p-IKKβ、p-IκBα和NF-κBp65蛋白表达明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；Q1组、Q2组、Q3组比较，细胞中IKKβ、Bcl-2、p-IKKβ、p-IκBα和NF-κBp65蛋白的表达依照布洛芬作用浓度的增加而依次降低，具有浓度依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 布洛芬可以抑制人肝癌QGY-7703细胞的增殖，促进细胞凋亡，可能与布洛芬调控细胞IKKβ/IκBα/NF-κB信号通路有关。【关键词】肝肿瘤；布洛芬；肝癌QGY-7703细胞；增殖；凋亡；信号通路

布洛芬是一种非选择性抑制环氧化酶（cyclooxygen a se，COX）的非甾体类抗炎药物（non-steroids antiinflammatory drugs，NSAIDs），是临床上常用的镇痛药物之一。研究表明，布洛芬能较好地抑制前列腺癌和卵巢癌细胞增殖［1-2］，然而其对肝癌细胞的影响鲜有报道，其抑制癌细胞增殖的机制尚未明确。本研究旨在探讨布洛芬是否通过IKKβ/IκBα/NF-κB通路相关因子调控肝癌细胞的增殖及凋亡。

1 材料和方法

1.1 药品、试剂及仪器

人肝癌QGY-7703细胞由广西肿瘤防治研究所实验室提供；99%纯度的布洛芬（大连美仑生物技术有限公司），实验中用DMSO溶解（DMSO终体积分数小于1‰），－20℃避光冷藏备用；RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、DMSO（Gibco公司，美国）；CCK-8细胞增殖/毒性检测试剂盒（同仁公司，日本）；T ri zol（Invitrogen公司，美国）；PCR引物、反转录试剂盒、Real-Time PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；细胞凋亡试剂盒（BD公司，美国）；细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）；显色试剂盒（中杉金桥生物技术有限公司）；鼠抗人磷酸化IKKβ（p-IKKβ）单克隆抗体、鼠抗人磷酸化IκBα（p-IκBα）单克隆抗体、鼠抗人NF-κBp65多克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体、山羊抗鼠辣根过氧化物酶标记二抗（博世德生物技术有限公司）；CKX41型倒置显微镜、倒置荧光显微镜（Olympus公司，日本）；Western blot图像分析软件（Bio-Rad公司，美国）；Prism7300实时定量PCR（ABI公司，美国）；VICTOR3酶标仪（PerkenElmer公司，美国）。

1.2 细胞培养及分组

选择人肝癌QGY-7703细胞培养于10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37°C、5%CO2、100%湿度细胞培养箱，细胞贴壁80%时以0.25%胰酶消化传代，2～3 d传一代。取对数生长期的细胞，制成单细胞悬液，在培养板或培养瓶中培养24 h，采用随机数字表法，将细胞随机分为对照组（Qc组）和不同浓度布洛芬组，每组6例：Q1组（布洛芬作用浓度为250μmol/L）、Q2组（布洛芬作用浓度为500μmol/L）、Q3组（布洛芬作用浓度为1000μmol/L）、Qc组加入等容量的RPM I-1640培养基。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖抑制情况

调整细胞浓度至2×104个/mL，将悬液以100μL/孔接种于96孔板中。培养24 h后弃上清液，加入含布洛芬且终浓度分别为250μmol/L、500μmol/L、1 000μmol/L的新培养液100μL，同时设不用药孔，每组设6个复孔。分别培养至24 h、48 h、72 h后，每孔加入CCK-8溶液10μL，继续培养2 h，取出培养板，酶标仪测定450 nm处的吸光度（OD值），每孔测量3次，取其平均值。计算细胞增殖抑制率：增殖抑制率＝（1－给药组OD值/对照组OD值）×100%。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡情况

调整细胞浓度至2×105个/mL，分别将悬液以2mL/孔接种于6孔板，培养24 h后弃上清液，并在相应组加入不同浓度布洛芬或培养液，每孔设6个复孔。分别培养至24 h、48 h、72 h后，再以0.25%的胰酶消化收集细胞，调整待测细胞密度为1×106个/mL。每个样本各取1mL细胞离心后加入冷PBS使细胞悬浮，再次离心后将细胞重悬于100μL的结合缓冲液中，依次加入5μL AnnexinV和5μL PI，轻轻混匀，避光下室温15 min。加入400μL结合缓冲液，立即上机检测，采用流式细胞仪测定细胞凋亡率。

1.5 实时荧光定量PCR检测细胞IKKβmRNA和Bcl-2 mRNA表达情况

调整细胞浓度至2.5×105个/mL，分别将悬液以4mL/瓶接种于25 cm2培养瓶，培养24 h后弃上清液，并在相应组加入不同浓度布洛芬或培养液，每组做6个重复。培养48 h后，收集细胞，用Trizol法提取RNA，按照反转录试剂盒说明反转录为cDNA。4倍浓度梯度稀释模板cDNA并制作标准曲线，确定基因的扩增效率，确定cDNA上样浓度，逆转录产物作为下一步PCR模板。PCR扩增所用的寡核苷酸引物序列见表1。按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行操作，根据反应条件在每个循环延伸末端收集荧光信号，绘制扩增曲线。40个循环后设置反应步骤，由55℃升温到95℃过程中，每0.5℃采集荧光信号，绘制融解曲线，采用2-△△Ct法计算相对表达量。

表1 各基因的上下游引物序列（片段大小19～22 bp）

1.6 Western blot法检测细胞IKKβ、p-IKKβ、p-IκBα、NF-κBp65和Bcl-2蛋白的表达情况

调整细胞浓度至2.5×105个/mL，分别将悬液以4 mL/瓶接种于25 cm2培养瓶，培养24 h后弃上清液，并在相应组加入不同浓度布洛芬或培养液，每组做6个重复。培养48 h后，收集细胞，提取总蛋白及核蛋白，用BCA蛋白质检测试剂盒测定并调节蛋白浓度，－70℃冰箱保存备用。以β-actin作为内参照，各组取等量蛋白经SDS-PAGE分离后转到PVDF膜上。PVDF膜放入封闭缓冲液（含5%脱脂奶粉TBS），室温封闭 1 h，分别加入IKKβ、p-IKKβ、p-IκBα、NF-κBp65和Bcl-2一抗，4℃过夜，用辣根过氧化酶标记的相应二抗室温孵育2 h。化学发光法显色，凝胶成像分析仪进行图像分析，以β-actin作为内参照，用目的蛋白吸光度值/内参照吸光度值的比值进行统计比较。

1.7 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖抑制和凋亡情况

与Qc组比较，Q1组、Q2组、Q3组细胞增殖抑制率及细胞凋亡率增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；Q1组、Q2组、Q3组比较，细胞增殖抑制率及细胞凋亡率依照布洛芬作用浓度增加和时间延长而依次增加，具有浓度和时间依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 不同浓度不同作用时间布洛芬孵育肝癌QGY-7703细胞增殖抑制率和凋亡率的比较［（±s）%］

表2 不同浓度不同作用时间布洛芬孵育肝癌QGY-7703细胞增殖抑制率和凋亡率的比较［（±s）%］

与Qc组比较，aP＜0.05；与Q1组比较，bP＜0.05；与Q2组比较，cP＜0.05；与24 h比较，dP＜0.05；与48 h比较，eP＜0.05

组别 n增殖抑制率Qc组 6 Q1组 6 Q2组 6 Q3组 6凋亡率24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 0 0 0 4.4±0.9 4.5±0.9 4.9±0.9 14.2±1.2a22.4±1.8ad34.9±2.4ade8.2±1.2a13.2±1.3ad23.5±1.4ade23.8±1.6ab33.2±1.5abd54.3±2.8abde18.6±1.4ab28.6±1.9abd37.9±2.9abde35.4±2.1abc47.6±3.4abcd72.1±3.6abcde26.2±1.5abc36.1±2.2abcd58.2±3.9abcde

2.2 布洛芬对肝癌QGY-7703细胞信号通路因子基因和蛋白表达的影响

与Qc组比较，Q1组、Q2组、Q3组细胞IKKβmRNA和Bcl-2 mRNA表达明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；Q1组、Q2组、Q3组比较，细胞IKKβmRNA和Bcl-2mRNA表达依照布洛芬作用浓度的增加而依次下降，具有浓度依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Qc组比较，Q1组、Q2组、Q3组细胞IKKβ、Bcl-2、p-IKKβ、p-IκBα和NF-κBp65蛋白的表达明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；Q1组、Q2组、Q3组比较，细胞IKKβ、Bcl-2、p-IKKβ、p-IκBα和NF-κBp65蛋白的表达依照布洛芬作用浓度的增加而依次下调，具有浓度依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3、图1。

表3 布洛芬对肝癌QGY-7703细胞信号通路因子基因和蛋白表达的影响（±s）

表3 布洛芬对肝癌QGY-7703细胞信号通路因子基因和蛋白表达的影响（±s）

与Qc组比较，aP＜0.05；与Q1组比较，bP＜0.05；与Q2组比较，cP＜0.05

组别 n mRNA表达Qc组 6 Q1组 6 Q2组 6 Q3组 6蛋白表达IKKβ Bcl-2 IKKβ p-IKKβ p-IκBα NF-κBp65 Bcl-2 1.00±0.03 1.00±0.03 0.49±0.05 0.45±0.06 0.44±0.04 0.49±0.08 0.68±0.09 0.81±0.08a0.82±0.09a0.36±0.04a0.30±0.05a0.29±0.02a0.36±0.07a0.53±0.04a0.61±0.05ab0.70±0.04ab0.27±0.02ab0.16±0.02ab0.19±0.04ab0.27±0.03ab0.41±0.06ab0.43±0.06abc0.52±0.06abc0.19±0.03abc0.10±0.03abc0.06±0.01abc0.14±0.02abc0.31±0.05abc

图1 布洛芬对肝癌QGY-7703细胞IKKβ、p-IKKβ、Bcl-2、p-IκBα和NF-κBp65蛋白表达的影响

3 讨论

近年来N S AID对癌细胞生物学行为影响的研究越来越受重视。有研究证明，长期服用布洛芬的患者患前列腺癌、结直肠癌和其他癌症的风险大大降低，同时布洛芬除可通过依赖COX-2途径外，还可通过非依赖COX-2途径抑制肿瘤的发生和发展［3-4］。NF-κB为重要的信号传导因子，可以进入细胞核内与相应的靶序列结合，介导靶基因转录，调节编码生长因子、细胞黏附分子以及影响凋亡基因的表达［5-6］。研究表明IKKβ可通过调节NF-κB活化调控促炎靶基因的转录，释放炎症产物参与肝炎、肝纤维化及肝癌的病理生理过程［7-8］。已经证实NF-κB在多数肝癌细胞中有较高的表达，抑制肝癌细胞中NF-κB通路可以促进细胞凋亡［9-10］。此外，有研究显示布洛芬可以抑制结肠癌细胞和淋巴瘤细胞中NF-κB通路的活性，进而影响下游靶基因的表达［11-12］。

本研究结果显示，布洛芬可以抑制肝癌QGY-7703细胞增殖，同时也能促进细胞凋亡，且具有浓度和时间依赖性。布洛芬能够下调肝癌QGY-7703细胞NF-κBp65的表达，其抑制因子IκBα的磷酸化也受到抑制。上游信号分子IKKβ的检测表明，布洛芬可以抑制IKKβ及其磷酸化，进而抑制NF-κB信号通路，表明布洛芬在肝癌QGY-7703细胞中可通过蛋白激酶水平的作用抑制IKKβ/IκBα/NF-κB信号通路活化。同时，不同浓度布洛芬组Bcl-2基因mRNA和蛋白表达均下调，现已知抗凋亡基因Bcl-2是IKKβ/IκBα/NF-κB信号通路重要的靶基因之一，而且抑制细胞NF-κB活性后诱导的凋亡与Bcl-2表达下调相关。因此本研究结果表明布洛芬抑制肝癌QGY-7703细胞增殖，促进其凋亡的作用机制可能与IKKβ/IκBα/NF-κB信号通路密切相关，且可负性调控下游靶基因Bcl-2mRNA和蛋白的表达。

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［2016-12-12收稿］［2017-02-02修回］［编辑 江德吉］

Effect of ibuprofen on apoptosis and proliferation of hepatic cells via the IKKβ/IκBα/NF-κB signaling pathway

Nan Zhenhua，Pan Linghui，Zhang Weikang（Department of Anesthesiology，Affiliated Tumor Hospital of GuangxiMedical University，Nanning 530021，P.R.China）

Pan Linghui.E-mail：plinghui@hotmail.com

Objective To investigate the effect of ibuprofen on apoptosis and proliferation of hepatic cells via the IKKβ/IκBα/NF-κB signaling pathway.M ethods Human liver cancer QGY-7703 cells in logarithmic growth phase were seeded into culture plates or bottles.The cells were randomly divided into 4 groups using random number table（n=6 each）：control group（Qc group）and 3 experimental groups given different ibuprofen concentrations（Q1，Q2，Q3groups）.The Q1，Q2and Q3groupswere exposed to ibuprofen at respective final concentrations of 250，500 and 1000μmol/L，while the control group was exposed to normovolemic RPM-l640 nutrient solution.Cell proliferation at 24，48 and 72 h later wasmeasured using the CCK-8 assay，and apoptosis rate wasmeasuredusing flow cytometry.After 48 h incubation，levels of IKKβand Bcl-2 mRNA and protein，as well as levels of p-IKKβ，p-IκBα and NF-κBp65 protein，weremeasured using real-time PCR or Western blotting.Results Proliferation rates and apoptotic rates were significantly higher in the Q1，Q2and Q3groups than in the Qc group.These effects depended on ibuprofen dose and incubation time. Levels of IKKβand Bcl-2 mRNA were significantly lower in Q1，Q2and Q3groups than in the Qc group，and this effect varied with ibuprofen concentration.Similarly，protein levels of IKKβ，Bcl-2，p-IKKβ，p-IκBαand NF-κBp65 were significantly lower in the Q1，Q2and Q3groups than in the Qc group.All these levels negatively correlated with ibuprofen concentration（P＜0.05）.Conclusions Ibuprofen can inhibit proliferation and induce apoptosis in human liver cancer QGY-7703 cells，and itmay exert these effects by regulating IKKβ/IκBα/NF-κB signaling.

Liver neoplasms；Ibuprofen；Liver cancer QGY-7703 cells；Proliferation；Apoptosis；Signaling pathway

R735.7

A

1674-5671（2017）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.01.06

广西科学研究与技术开发计划资助项目（2013BC26260）

潘灵辉。E-m ail：plinghui＠hotmail.com