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临床常用几种抗菌药物对HPS抗菌活性研究

2017-05-30邵莉萍张继瑜马志永

安徽农业科学 2017年33期
关键词:环丙沙星

邵莉萍 张继瑜 马志永

摘要[目的]研究抗菌药物恩诺沙星、环丙沙星、加替沙星对27株副猪嗜血杆菌临床分离株体外抗菌活性,从而观察副猪嗜血杆菌对喹诺酮类抗菌药物的敏感性。[方法]采用微量肉汤稀释法测定MIC,参考标准为美国临床和实验室标准协会(CLSI)。[结果]恩诺沙星(MIC50,MIC90,0.25 μg/mL,2 μg/mL)、环丙沙星(MIC50,MIC90,0.125 μg/mL,2 μg/mL)、加替沙星(MIC50,MIC90,0.125 μg/mL,1 μg/mL)均表现出一定的抑菌活性,且加替沙星的抑菌活性最明显。在耐药性方面,副猪嗜血杆菌对恩诺沙星的耐药性最强(222%),环丙沙星(3.8%)和加替沙星(7.4%)具有轻微的耐药性。[结论]抗菌药物恩诺沙星、加替沙星以及环丙沙星对副猪嗜血杆菌临床分离株具有一定的抗菌活性,在耐药性方面,HPS已经对恩诺沙星表现出一定的耐药性,因此,今后在临床上遇到副猪嗜血杆菌引起的相关疾病,可以采用合理的给药方案进行疾病的治疗,对于预防耐药菌株产生至关重要。

关键词恩诺沙星;加替沙星;环丙沙星;副猪嗜血杆菌;MIC

中图分类号S858.8文献标识码

A文章编号0517-6611(2017)33-0113-02

Research of Antibacterial Activity of Clinical Commonly Used Drugs against HPS

SHAO Liping1, ZHANG Jiyu1*, MA Zhiyong2

(Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences ,Chinese Academy of Agricultural Sciences , Lanzhou ,Gansu 730050;2.Shanghai Veterinary Research Institute,Shanghai 200241)

Abstract[Objective ]The purpose of the research is to evaluate the activity of the enrofloxacin,ciprofloxacin,gatifloxacin against heamophilus parasuis(27 isolates) , and we can estimate the ability of the quinolone compounds and oxazolidinone antibacterial against heamophilus parasuis(HPS).[Method] Broth microdilution method was used to determine MIC, following the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) recommendations.[Result] Enrofloxacin(MIC50,MIC90,0.25ug/mL,2ug/mL),ciprofloxacin(MIC50,MIC90,0.125ug/mL,2ug/mL) , gatifloxacin(MIC50,MIC90,0.125ug/mL,1ug/mL)exhibited activity against HPS,gatifloxacin was the best one of compounds in aspect of inhibition HPS.In repect of resistance , HPS was most resistant for enrofloxacin(22.2%), and showed a little resistance for ciprofloxacin(3.8%) and gatifloxacin(7.4%) .[Conclusion] The compounds of quinolone revealed better antibacterial activity than the oxazolidinone antibacterial-linezolid, and linezolid dosent show the function to restrain HPS.As respect of resistance , HPS reveals severe resistance for enrofloxacin .So , it is important for us to adopt the right ways to choose relevant drugs , when we encounter the diseases caused by HPS.

Key wordsEnrofloxacin; Gatifloxacin; Ciprofloxacin;HPS; MIC

副豬嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪呼吸道一种常在菌,起初该病原菌被称为猪嗜血杆菌,后来证明其生长时不需要X因子(血红素和其他卟啉类物质),需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD或V因子),因此将其命名为HPS[1]。形态学上,HPS革兰氏染色成红色,属于革兰氏阴性菌,在光学显微镜下观察,HPS菌体呈多形性,从单个的球杆菌到细长的丝状菌体均可见。该菌在体外培养时非常脆弱,存活时间短,容易自行死亡,在TSA固体培养基上长出光滑、透明的灰白色针尖大菌落,HPS感染引起猪多发性浆膜炎和关节炎以及脊髓炎,被称之为格拉斯氏病[2-3]。该病常呈继发感染,在机体遭受应激或者病毒感染时,常常会侵入动物体内,引起动物发病,属于典型的机会致病菌。易感猪群为2~8周龄的断奶前后仔猪,以及1~4月龄的保育阶段猪,发病率为10%~15%,死亡率可达50%,降低了猪出栏率,给生猪养殖行业带来巨大的经济损失。临床常用疫苗来对未发病的猪群进行免疫,但是,由于受血清性的多样性和非特异性致病菌的分离数量增加等因素影响,使得交叉保护疫苗的开发应用尤为困难。

抗菌药是临床实际应用于治疗该疾病的主要选择。抗菌药作为抗菌的有效化合物,已经是全世界养殖户用于抵抗细菌感染最常用的临床药物。但是长期滥用抗生素使细菌极易产生耐药性,甚至出现超级细菌,例如,耐甲氧西林金葡菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、耐青霉素肺炎链球菌、多重耐药性结核杆菌以及耐万古霉素肠球菌。这些耐药菌的出现,给临床细菌病的治疗造成困难,严重影响疫病的治疗效果,使得一些细菌病难以得到有效的控制。据国内外研究报道,临床分离的HPS当中,存在三甲氧苄氨嘧啶+磺胺甲噁唑耐药菌株,也有部分对新霉素耐药,此外西班牙学者发现临床分离的HPS对青霉素、氨苄青霉素、土霉素、红霉素以及替米考星等常见药物存在耐药现象。后来,中国的研究学者发现,临床分离的HPS对喹诺酮类、头孢类以及庆大霉素出现了耐药现象[4-5]。

抗菌药物对HPS的敏感性检测的试验对于格拉斯氏疾病的治疗是尤为重要的,目前,国内外很少有关于抗菌药物对副猪嗜血杆菌敏感性试验的研究报告。为此,研究27株HPS临床分离菌对喹诺酮类药物恩诺沙星(enrofloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)的敏感性(图1),从而为临床用药提供给药方案指导。喹诺酮类化合物是一类人工合成的含4-喹诺酮基本结构的抗菌药,对革兰氏阴性菌具有良好的抗菌活性和较强的药代学特性,自20世纪60年代问世以来,已经经历4代的结构改造与修饰,目前兽医临床常用的为第3代的环丙沙星和恩诺沙星,以及第4代的加替沙星,其中恩诺沙星兽医临床应用最为广泛[6-7]。但是,自2000年以来,临床常见致病菌对喹诺酮类药物的耐药性在临床疾病的治疗中越发普遍,特别是肠道菌的耐药性。因此,观察喹诺酮类药物对HPS的抑菌活性,对于预防耐药菌产生具有重要的指导意义[7]。

图1恩诺沙星(enrofloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)化学结构结构

Fig.1The chemical structures of enrofloxacin,ciprofloxacin and gatifloxacin

1材料与方法

1.1药品

恩诺沙星,纯度98%,由北京索莱宝科技有限公司提供;環丙沙星,纯度98%,由上海麦克林生化科技有限公司提供;加替沙星,纯度98%,由上海麦克林生化科技有限公司提供。

1.2菌株

HPS临床分离株27株,由上海兽医研究所马志永研究员馈赠。

1.3质控菌株流感嗜血杆菌ATCC49247,购自北纳生物。

1.4主要试剂

大豆胰蛋白胨琼脂(tryptone soya agar,TSA)和大豆胰蛋白胨肉汤(tryptone soya broth,TSB)培养基购自青岛海博生物技术有限公司,新生牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司,辅酶Ⅰ(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,NAD)购自biosharp。

1.5培养基配置

将液体培养基TSB按照产品要求配置一

定体积的培养液,高压灭菌之后,冷却至45 ℃左右,无菌加

入过滤除菌的10%NAD及5%新生牛血清,放置在4 ℃条件下备用。

1.6抗菌药液与菌液的制备

抗菌药液制备:试验前精密称取恩诺沙星、环丙沙星、加替沙星,无菌操作配制成2048 μg/mL的药液,放置4 ℃冰箱保存备用,临用前用相应的细菌培养液稀释至试验需要的浓度。恩诺沙星、加替沙星用DD水作溶剂,振荡30 min;环丙沙星用甲醇做溶剂,振荡30 min。

菌液配置:

挑取单菌落接种至已制备好的TSB液体培养基当中,置37 ℃振荡培养20 h后,用TSB培养基稀释菌液,直至菌液浓度为0.5麦氏单位。

1.7最小抑菌浓度(MIC)测定

采用微量肉汤稀释法分别测定待测药物对每株菌株的MIC,试验参考标准美国临床和实验室标准协会(CLSI)[8-9]。将一定浓度的待测药物倍比稀释到96孔板各试验孔中,稀释梯度为15个梯度,浓度范围为256~0.015625 μg/mL。然后用相应的细菌培养液稀释已调节至0.5麦氏单位浓度的菌液,稀释后的菌液在15 min内完成接种,保证每孔细菌的终浓度为5×105CFU/mL,每孔对应的药物浓度分别为相应的15个梯度所对应的浓度。阴性对照组为接种细菌的细菌培养液。当阴性对照组长出细菌时,试验结果方可采纳。

2结果与分析

药物对27株HPS的MIC结果见表1,可以看出,恩诺沙星(MIC50,MIC90,0.25.0 μg/mL,2 μg/mL)、环丙沙星(MIC50,MIC90,0.125 μg/mL,2 μg/mL)、加替沙星(MIC50,MIC90,0.125 μg/mL,1 μg/mL)均表现出良好的抑菌活性,喹诺酮类药物当中,HPS对恩诺沙星的耐性最强(22.2%),而对加替沙星的敏感性最强(93.0%),环丙沙星介于恩诺沙星和加替沙星之间。由此可见,喹诺酮类药物恩诺沙星对HPS已经产生一定的耐药性,对环丙沙星和加替沙星的耐药性还不是特别强烈,其中对于加替沙星的敏感性最好(表2)。

3结论与讨论

HPS是猪呼吸道常在菌。在一定的条件下,就会侵入猪体内,例如猪蓝耳病、猪丹毒、猪肺疫以及仔猪腹泻等疾病致使猪抵抗力低下,此时HPS突破机体黏膜屏障,侵入体内,引起猪发病。病理变化为猪心脏呈绒毛心,肝脏表面出现白色被膜[10]。近几年来,随着抗菌药物的大范围使用,细菌的耐药性问题也越来越严重,目前,HPS对喹诺酮类药物的耐药性正在逐渐增强,临床上,HPS菌株耐药性在逐渐增强,尤其对大环内酯类、四环素类、β-内酰胺类、喹诺酮类以及磺胺类药物的耐药性,而这些药物是格拉斯氏病临床治疗常用的有效药物。喹诺酮类化合物恩诺沙星、环丙沙星以及加替沙星曾因抗菌谱广泛抗菌活性突出,特别是对于多重耐药菌,在世界范围内广泛应用。在2009—2010年,宋德平等[11]、方泉明等[12]对江西的HPS临床分离株做了药敏试验,结果表明HPS对猪场大量使用的链霉素、青霉素等抗生素具有一定的耐药性,但是对头孢类抗菌药物则比较敏感。后来,在2015年,魏光河[13]对重庆地区的HPS进行药敏试验,结果发现该地区菌对第3代头孢和多黏菌素类药品极度敏感,敏感率高达100%,而对于四环素类、喹诺酮类、大环内酯类以及青霉素类均表现出33.3%~100%的耐药性。

该研究发现,喹诺酮类药物对革兰氏阴性菌的抗菌效果显著,比如肠道、呼吸道或者全身性的革兰氏阴性菌,然而,由于在临床上的滥用,使得其耐药范围越来越广,耐药机理也是千变万化。该试验研究的HPS临床分离菌,恩诺沙星的耐药性最强,达到22.2%,其次是加替沙星(7.4%)和环丙沙星(3.8%),而加替沙星的敏感率最高,为93.0%。恩诺沙星的耐药率大约是环丙沙星的7倍,加替沙星的3倍。因此,当临床格拉斯氏疾病发生时,可以采用加替沙星或环丙沙星作为治疗药物进行给药,切记勿滥用药物,以防止更多的耐药菌的产生。

参考文献

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