山黄皮果实和叶片挥发油成分分析

覃振师　贺鹏　王文林　张涛　宋海云　谭秋锦　汤秀华　许鹏　黄锡云　郑树芳　何铣扬　陈海生

摘要：[目的]考察山黄皮桂研15号果实（含果肉和果皮）和叶片挥发油化学成分差异，以挖掘山黄皮桂研15号的利用价值，为山黄皮资源的开发利用提供科学依据。[方法]采用水蒸汽蒸馏法提取山黄皮果实和叶片挥发油，通过气相色谱一质谱联用仪（GC-MS）对山黄皮不同部位挥发油化学成分进行分析；通过NIST标准质谱图库分别鉴定各化学组分；经面积归一化法测定山黄皮不同部位挥发油中化学成分的相对含量。[结果]从山黄皮桂研15号果实和叶片中共鉴定出55种化合物，其中萜烯类28种、醇类4种、醛类6种、酮类2种、酯类4种、碳氢化合物类6种、醚类5种。从山黄皮果肉、果皮及叶片挥发油中分别鉴定出20、31和34种化合物，其相对含量占各自挥发油总量的76.97%、95.11%和83.85%。山黄皮果肉、果皮及叶片挥发油的主要成分分别为单萜类化合物β-蒎烯、月桂烯和萜品油烯。因此，山黄皮桂研15号果实和叶片挥发油化学成分以萜烯类化合物（主要是单萜类化合物）和醚类化合物为主。[结论]山黄皮桂研15号果实和叶片挥发油化学成分成分种类和含量存在明显差异，且有独特的挥发油成分。综合成本因素，山黄皮桂研15号叶片挥发油具有更大的开发潜力。

关键词：山黄皮；果实；叶片；化学成分；挥发油；气相色谱-质谱法

0引言

[研究意义]山黄皮[Clausena anisum-olena（Blauco）Merr.]为芸香科（Rutaceae）黄皮属（Clausena）常绿多年生小乔木或大灌木，俗称鸡皮果，主要分布于我国广西、云南和广东等地，越南及菲律宾也有分布（黄峰等，2005）。山黄皮的果实味酸可口，香气怡人，富含门冬氨酸、Y-氨基丁酸、丙氨酸等氨基酸（杨益林和黄艳，2011），具有助食消暑、祛痰化气、消积消滞、疏通肠胃等功效，其叶可人药，有引气、健胃、止痛、消风肿、去疳积等功能。山黄皮挥发油对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、杀螟杆菌、大肠杆菌及枯草杆菌等有抑制作用（苏秀芳等，2011a，2011b）。研究山黄皮果肉、果皮和叶片挥发油成分及其相对含量差异，对有效开发利用山黄皮具有重要意义。[前人研究进展]随着人们对天然、绿色产品需求的日益增加，山黄皮产品市场空间越来越宽广，有关其天然产物活性成分的研究逐渐成为热点。Wang等（2008a，2008b，2009a，2009b，2010）运用植物化学手段，从山黄皮地上脂溶性部分中分离鉴定出1种新环八肽Clausenain B和7种新的单萜类香豆素。余焘等（2009）对广西崇左中越边境山黄皮叶片进行水蒸汽蒸馏，经GC-MS分析鉴定出山黄皮叶片挥发油中主要成分为（+）-4-蒈烯（45.67%）、2-甲基-2，6-叔丁基苯酚（40.84%）等。梁立娟等（2011）运用气相色谱一质谱联用仪（GC-MS）对水蒸汽蒸馏法提取的桂研20号果实挥发油进行成分分析，鉴定出其主要成分为（+）-4-蒈烯、肉豆蔻醚、异松油烯和（+）-柠檬烯等。苏秀芳等（2011a）对广西民族师范学院龙州校区院内景观用品种山黄皮果仁以水蒸汽蒸馏，经GC-MS分析鉴定出其挥发油主要成分为4-甲氧基-6-（2-丙烯基）-1，3-亚甲二氧基苯（47.07%）等，且挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及杀螟杆菌具有较强的抑制作用。苏秀芳和梁振益（2011）对广西扶绥县野生品种山黄皮茎、根、叶、果实及花以水蒸汽蒸馏，经GC-MS分析鉴定出其共有的主要成分为4-甲氧基-6-（2-丙烯基）-1，3-苯并二嗯茂，在果实中含量为58.40%。Thaia等（2014）对越南谅山市山黄皮果实和叶片以水蒸汽蒸馏，经GC-MS分析鉴定出山黄皮果实和叶片挥发油中主要成分萜品油烯等占总峰面积的53%以上。You等（2015）研究发现山黄皮叶片挥发油中主要成分是肉豆蔻醚、萜品油烯、2-（4-甲基苯基）丙2-醇、3一蒈烯，其对常见粮仓害虫烟草甲虫（Lasioderma serricorne）和嗜卷书虱（Lipo scelis bostrychophila）成虫具有较强排斥性。[本研究切入点]前人对山黄皮不同部位挥发油成分的研究主要集中在种植面积相对较少的景观型及野生型品种上，目前有关主栽品种如山黄皮桂研15号等的挥发油成分分析研究报道较少。[拟解决的关键问题]采用GC-MS分析山黄皮桂研15号的果肉、果皮及叶片挥发油成分，为开发山黄皮资源开发利用提供科学依据，以期开发出山黄皮系列产品，延长产业链，提高果农收入。

1材料与方法

1.1试验材料

以广西南亚热带农业科学研究所选育的山黄皮品种桂研15号为材料。选取5株长势、树形相似的成年结果果树，从每株果树树冠的东、西、南、北4个方向采摘处于同一成熟度的成熟果实5个、颜色相近的叶片10片，各自混合带回实验室，置于20℃冰箱冷藏。主要仪器设备：GC-MS（美国Thermo Electron FinniganTrace DSQ公司）、电子天平（型号BTl24S，赛多利斯公司）。试剂：NaCl、无水硫酸钠（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、超纯水（自制）。

1.2试验方法

1.2.1预处理 将成熟期山黄皮果实的果肉与果皮分离，果肉均匀浆，果皮和叶片均切成0.5 cm×0.5cm的小块，捣碎。

1.2.2蒸馏提取方法 准确称量样品150.0 g，置于1000 mL圆底烧瓶中，加入0.6%NaCl溶液，摇匀，冷凝回流。自冷凝管上端加无离子水充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流人烧瓶时为止。测定器置电热套中微沸4 h，停止加热，静置片刻，将水缓缓放出，放出香精油，经无水硫酸钠干燥后，用适量正已烷溶解，过0.22 m有机滤膜，用于GC-MS分析。试验重复3次。

1.2.3 GC-MS分析条件

1.2.3.1色谱条件 DB-5MS 5%苯基甲基聚硅氧烷毛细管柱（30.00 mx0.25 mm，0.25 m）。载气为高纯度氦气（>99.999%），流速1.0 mL/min，進样口温度250℃。柱温采用升温程序：60℃保持1 min，以5℃/min升温至280℃，保持10-min。进样量0.5uL，分流比100：1，溶剂延迟1 min，恒流模式进样。

1.2.3.2质谱条件 电离方式：EI源，电离能量70eV，离子源温度203℃，传输线温度280℃。其他参数为标准自动调谐参数。质量扫描范围：30-600 m/z。

1.2.4检索方式 仪器自动检测索，依据为NIST标准质谱图库。对谱库中化合物匹配程度（O）低于80（最大值为100）的组分标为未鉴定出。采用峰面积归一法计算各成分的相对含量，即计算各峰面积及其总和，并求出占总峰面积的百分率。

1.3统计分析

试验数据采用Excel 2003进行整理及分析。

2结果与分析

2.1山黄皮果实和叶片的挥发油成分组成及其含量分析

由表1和表2可知，从山黄皮果实和叶片中共鉴定出55种化合物，其中萜烯类28种、醇类4种、醛类6种、酮类2种、酯类4种、碳氢化合物类6种、醚类5种。果肉与果皮共有的化合物有13种，分别是9种萜烯类、1种碳氢化合物类和3种醚类。果实（含果肉和果皮）与叶片共有的化合物有11种，分别为8种萜烯类（蒎烯、b-trans-ocimene、（z）-3，7-二甲基-1，3，6-十八烷三烯、萜品烯、萜品油烯、y-pyronene、1-石竹烯、l-b-红没药烯）和3种醚类（丁香酚甲醚、肉豆蔻醚、榄香素）。由表2可知，山黄皮桂研15号果肉中鉴定出20种挥发油成分，占总峰面积的76.97%。其中，萜烯类13种，含量最高，占总峰面积的66.10%；其次为醚类3种，占总峰面积的10.22%；仅存在于果肉挥发油中的化合物有4种，分别为3，7-二甲基-1，3，7-辛三烯、Germacrene B、壬醛和2，4-二甲基苯乙烯。从果皮中鉴定出31种挥发油成分，占总峰面积的95.11%。其中，萜烯类19种，含量最高，占总峰面积的78.53%；其次为醚类5种，占总峰面积的15.71%；仅存在于果皮挥发油中的化合物有13种，分别为Sabenene、皮蝇磷、月桂烯、（+）-香橙烯、b-cis-famesene、Leden、3，7，11，11-tetramethylbicyclo[8.1.0]2，6-u-ecadiene、1-壬醇、Myrtanol、橙花醇、（E）-3，7-二甲基-2，6-辛二烯醛、胡椒酮和Perillene。从叶片中鉴定出34种挥发油成分，占总峰面积的83.85%。其中，萜烯类18种，含量最高，占总峰面积的74.99%；其次为醚类3种，占总峰面积的4.22%；仅存在于叶挥发油中的化合物有17种，分别为a-ylangene、a-石竹烯、（+）-a-elemene、（-）-b-cadinene、y-榄香烯、苯乙醇、2-己烯醛、（E，E）-2，4-己二烯醛、苯甲醛、反-2，6-壬二醛、对甲基苯乙酮、2-己烯酸甲酯、水杨酸甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二异丁酯、4-异丙基甲苯和十八烷。综上所述，山黄皮不同部位挥发油成分中的化合物种类及其相对含量间均存在明显差异。

2.2山黄皮果实和叶片挥发油成分的主要组分及其相对含量分析

由表1和表2可知，山黄皮不同部位挥发油成分化合物中醇类、醛类、酮类、酯类和碳氢化合物及其相对含量较少，其主要成分是萜烯类化合物（尤其是单萜类化合物）和醚类化合物。山黄皮果肉挥发油组分的单萜烯类化合物B-蒎烯（FEMA编号2903）（表1）相对含量最高，其次为醚类化合物肉豆蔻醚及萜烯类化合物萜品油烯、3-蒈烯和l-b-红没药烯，其中，单萜类化合物相对含量总和占62.96%。B-蒎烯因具有多种潜在的生物活性而受到广泛关注（廖圣良等，2016），富含B-蒎烯的植物精油具有抗氧化（Kelen and Tepe，2008；Banday，2014）、杀菌（Kelenand Tepe，2008）、消炎（Woguem et a1.，2014）、抗肿瘤（Abdel-Hameed et a1.，2014）等活性，GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》批准其为允许使用的食用香料，编号S0659，目前主要生产方式是从松节油中单离出（林翔云，2007）。

山黄皮果皮挥发油组分的单萜烯类化合物月桂烯相对含量最高，其次为醚类化合物肉豆蔻醚及萜烯类化合物萜品油烯、l-b-红没药烯、1-石竹烯、3-蒈烯；山黄皮果皮中主要成分为单萜类化合物月桂烯（FEMA编号2762）（表1），用于番木瓜、芒果、香柠檬、橙及果汁混合甜饮料等香型配制（林翔云，2007），GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》将其批准为允许使用的食用香料，编号S0653，也可用于合成1-薄荷醇、香茅醛、新铃兰醛和龙涎酮等香料（杨阳等，2012）。

山黄皮叶片挥发油组分的单萜烯类化合物萜品油烯相对含量最高，其次为醚类化合物地肉豆蔻醚及萜烯类化合物1-石竹烯、a-萜品烯、1-b-红没药烯、B-蒎烯和醛类2-己烯醛。在山黄皮果肉、果皮和叶片挥发油中相对含量超过50.00%的萜烯类化合物分别为B-蒎烯（50.22%）、月桂烯（53.33%）和萜品油烯（55.37%），其单萜类化合物相对含量总和分别占62.96%、70.80%和64.99%，山黄皮叶片中主要成分单萜类化合物萜品油烯（FEMA编号3046）（表1）具有柠檬气味，也是生产合成香料的重要原料。

因此，山黄皮挥发油成分的主要组分为萜烯类化合物（主要是单萜类化合物）和醚类化合物。

3讨论

3.1山黄皮果实和叶片的挥发油成分比较

本研究从山黄皮桂研15号果实和叶片中共鉴定出55种化合物，其中萜烯类29种、醇类4种、醛类6种、酮类2种、酯类4种、碳氢化合物类6种、醚类5种；从果肉中鉴定出20种挥发油成分，从果皮中鉴定出31种挥发油成分，从叶片中鉴定出35种挥发油成分。果肉、果皮及叶片挥发油中共有的化合物有11种，分别为8种萜烯类（蒎烯、b-trans-ocimene、（z）-3，7-二甲基-1，3，6-十八烷三烯、萜品烯、萜品油烯、Y-pyronene、1-石竹烯和1-b-红没药烯）和3种醚类（丁香酚甲醚、肉豆蔻醚、榄香素）；而共有的化合物分别占果肉、果皮和叶挥发油含量的23.36%、37.66%和69.59%。其中，仅存在于果肉挥发油中的化合物有4种，其相对含量为1.02%；仅存在于果皮挥发油中的化合物有13种，其相对含量为55.75%；仅存在于叶片挥发油中的化合物有17种，其相对含量为6.75%。本研究中山黄皮桂研15号果肉挥发油成分及其相对含量与梁立娟等（2011）研究得出的山黄皮桂研20号挥发油成分及其相对含量不同，与苏秀芳等（2011b）报道的龙州产山黄皮变种细叶黄皮果实果肉挥发油成分及其相对含量也不同。梁立娟等（2011）研究发现，桂研20号果实果肉挥发油中相对含量较高的有肉豆蔻醚（64.85%）、（+）-4-柠檬酸（12.25%）等，其果皮挥发油中相对含量较高的有（+）-4-蒈烯（62.6%）、肉豆蔻醚（20.28%）等；苏秀芳等（2011b）研究发现，龙州产山黄皮变种细叶黄皮果实果肉挥发油中相对含量较高的有4-甲氧基-6-（2-丙烯基）-1，3-亚甲二氧基苯（47.07%）等。本研究结果与Molino（2000）不同，未鉴定出（E）-茴香脑和甲基胡椒酚；与苏秀芳和梁振益（2011）报道的也不同，未分离鉴定出山黄皮变种细叶黄皮茎、根、叶、果实及花挥发油的共有化合物为4-甲氧基-6-（2-丙烯基）-1，3-苯并二恶茂。在本研究中，桂研15号的叶片挥发油组分与余焘等（2009）研究结果相似，以萜品油烯（53.89%）含量最高，其次为肉豆蔻醚、3-蒈烯、B-月桂烯、（+）-4-蒈烯、芋烯、a-水芹烯、B-红没药烯和a-蒎烯等；鉴定出的化合物以单萜化合物为主，与Thaia等（2014）研究结果一致。其主要原因是提取的挥发油是一种混合物，其化学成分组成和相对含量受到植物品种、组织部位、生长环境、提取方法及采样时间等因素影响。

3.2山黄皮桂研15号挥发油的开发应用前景

本研究中山黄皮果实和叶片挥发油成分中共有的化合物相对含量较高的为醚类化合物肉豆蔻醚，但其具有毒性（陈宏降等，2011）、致幻作用（黄鑫和杨家伟，2007）、抗肝脏脂质过氧化作用（zheng et al.，1992）和癌症预防作用（Hattori et al.，1993）。果实和叶片挥发油化学成分种类和含量差异明显，果肉挥发油成分中B-蒎烯的相对含量达50.22%，果皮挥发油成分中月桂烯相对含量达53.33%，叶片挥发油成分中萜品油烯相对含量达55.37%。由此可见，山黄皮桂研15号果实可作为制作香料香精B-蒎烯和月桂烯的原料，叶片可作为制作单离萜品油烯的原料。另外，山黄皮果实挥发油主要成分B-蒎烯和月桂烯的基本特征与山黄皮果实具有令人愉快的、清淡的香脂气味挥发油类似，叶片挥发油主要成分萜品油烯的基本特征与山黄皮叶具有刺激性气味、同时兼具柠檬和树脂挥发油类似，由此可推断山黄皮果实挥发油主要是B-蒎烯和月桂烯的共同作用结果，而叶片挥发油主要是萜品油烯作用的结果。由于B-蒎烯、月桂烯和萜品油烯在山黄皮桂研15号不同部位挥发油中含量比例均较高，可作为香精香料及其原料予以開发，但综合成本因素，山黄皮桂研15号叶片挥发油具有更大的开发潜力。

4结论

山黄皮桂研15号果实及其叶片部位挥发油化学成分成分种类和相对含量存在明显差异，且有独特的挥发油成分。综合成本因素，山黄皮桂研15号叶片挥发油具有更大的开发潜力。