不同桂花品种开花及衰老过程中的花色物质成分分析

邹晶晶　曾祥玲　陈洪国　蔡璇　王彩云

摘要：[目的]分析不同花色桂花品种开花及衰老过程中的花色物质成分及其含量变化规律，为桂花花色资源开发和利用提供参考依据。[方法]分别选取代表橙色品种群的镉橙丹桂、代表黄白色品种群的厚瓣银桂和代表黄色品种群的柳叶金桂，运用高效液相色谱质谱法检测其开花过程中的花色物质组分及含量，用色差仪测定花色参数L*（颜色亮度）、a*（红/绿程度）、b*（黄/蓝程度）和c*（彩度），用多元线性回归分析法逐步筛选分析花色呈现与特征花色物质含量的关系；分析不同花色桂花品种衰老过程中特征花色物质含量的变化规律。[结果]桂花中含有5种黄酮类物质，可能为金鱼草素苷元、槲皮素苷元、芹菜素苷元、鼠李金苷元和柚皮素苷元，其中槲皮素苷元在镉橙丹桂、厚瓣银桂和柳叶金桂盛花期花瓣中的含量均较高，分别为134.55、89.41和90.39 ug/gFW。对a-胡萝卜素和B-胡萝卜素进行定量分析发现，两种类胡萝卜素仅在镉橙丹桂中含量较高，分别为72.94和99.72 yg/gFW。对花色呈现与花色物质含量关系的分析结果显示，槲皮素苷元决定花色的亮度L*，柚皮素苷元决定黄色程度b*，B-胡萝卜素决定红色程度a*。其中，槲皮素苷元含量在镉橙丹桂、厚瓣银桂和柳叶金桂开花过程中均呈先降低后升高的变化趋势，B-胡萝卜素含量在镉橙丹桂开花过程中呈明显的先升高后降低的变化趋势，柚皮素苷元含量在柳叶金桂开花过程中呈缓慢上升趋势。[结论]槲皮素苷元、柚皮素苷元及B-胡萝卜素为桂花的特征花色物质，其在镉橙丹桂、厚瓣银桂和柳叶金桂开花及衰老過程中的变化规律共同决定了不同花色桂花品种花色明亮度具有随着花朵开放时间推移呈先加深后逐步黯淡的特征，而基本花色不产生明显变化。

关键词：桂花；花色；特征花色物质；高效液相色谱质谱法

0引言

[研究意义]桂花（Osmanthus fragrans Lour.）是我国十大传统名花之一，自古享有“独占三秋压众芳”的美誉（刘玉莲，1985）。桂花花瓣中营养成分丰富，含多种维生素、微量元素和人体必需氨基酸，又有“百花营养之王”的美称（李军峰，2011）。桂花树也是我国重要的天然保健植物和特产经济香花植物，因其花香气浓郁，在食品、药用、香妆及天然色素提取等领域应用前景广阔（Cai et al.，2014；曾祥玲等，2016）。目前，关于桂花天然色素的研究多集中在提取工艺的探讨方面，对桂花具体花色物质成分及其在采收过程中变化规律的研究较少（侯丹，2014），对桂花开放及衰老过程中花色物质成分的变化规律尚未清楚。因此，提取桂花花色物质成分并分析其含量变化规律，对桂花分子育种、花色资源开发及及利用具有重要意义。[前人研究进展]桂花可根据不同品种的开花习性和颜色归为两大类四大品种群，即秋天开花秋桂类的金桂、银桂、丹桂三大品种群和四季开花的四季桂品种群（向其柏和刘玉莲，2008）。蔡璇等（2010）、Han等（2014）、张超等（2016）研究发现，桂花花瓣中的色素为类黄酮和类胡萝卜素，其中黄白色花以类黄酮化合物为主；橙色花中类胡萝卜素的种类及含量影响秋桂花色的呈现。此外，Chan等（2011）研究发现，植物体在不同发育阶段的物质代谢水平会发生变化，而导致不同品种或同一品种在不同开花时期花色及花香成分存在差异；阳韶昆等（2012）、zou等（2014）研究发现，桂花花瓣衰老过程中存在细胞程序性死亡现象，如蛋白酶活性减弱、核DNA断裂及染色质凝结等。[本研究切人点]四季桂品种群桂花的颜色较单一（黄色），秋桂类三大品种群桂花的颜色从橙红色到黄色到黄白色差异较明显，但目前关于不同花色桂花品种花色物质在其衰老过程中变化规律的研究鲜见报道。[拟解决的关键问题]选择同一生长地秋桂类不同花色桂花品种群镉橙丹桂（D.fragrans‘Gecheng Dangui）（橙色）、厚瓣银桂（D.fragrans‘Houban Yingui）（黄白色）和柳叶金桂（D.fragrans‘Liuye Jingui）3个花色代表品种，采用高效液相色谱质谱法检测其花色物质组分及含量差异，并测定花色参数L。（颜色亮度）、a*（红/绿程度）、b*（黄/蓝程度）和C*（彩度），分析与花色呈现密切相关的特征花色物质，进一步测定其在桂花开花过程中的变化规律，为桂花花色分子机理研究、花色资源开发及利用提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

供试3个花色桂花品种群代表品种分别为丹桂品种群的镉橙丹桂（橙色）、银桂品种群的厚瓣银桂（黄白色）和金桂品种群的柳叶金桂（黄色），以其盛花期的花瓣（图1）为试验材料，进行特征花色物质的提取、分离、鉴定及色差分析。

主要仪器设备：高效液相色谱质谱联用仪（日本岛津公司），SPD-M20A二极管阵列检测器，CTO-20AC色谱柱控温箱，SIL-20AC自动进样器，DGU-20A3脱气装置，LC-20AD二元梯度泵，柯尼卡美能达色差计（CM-2002，日本柯尼卡美能达公司），超纯水制备设备（法国密理博公司），BP210S电子分析天平（德国赛多利斯集团）。

试剂：乙腈、甲醇和甲基叔丁基醚（MTBE）为色谱纯（美国天地试剂有限公司）；磷酸、甲酸、氢氧化钾（KOH）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、三乙胺（TEA）、氯化钠（NaCl）、乙醇和丙酮均为分析纯（国药集团）；绿原酸、芹菜素、柚皮素及B-胡萝卜素标样购自美国sigma公司，芦丁标样购自中国药品生物制品检定所。

1.2试验方法

桂花于2015年9月20-25日在华中农业大学（湖北武汉）校园苗圃内采集。选择生境一致、长势良好的成年植株，分别于铃梗期（花苞期）、初花期、盛花期及末花期采集花瓣，采样时间为上午7：00-9：00。花期判断参照周媛（2008）的花期划分体系标准进行划分。

1.2.1花色物质类黄酮提取及HPLC-MS分析 参照蔡璇等（2010）的方法，称取0.5 g桂花花瓣，用10mL 50%乙醇溶液避光浸提3 h后，将得到的提取液用微孔滤膜（0.45 wn）过滤，供高效液相色谱分析用。色谱柱为日本维美希（YMC）公司的C18柱（150.0mmx4.6 mm），型号为Jsphere ODS-H80Ts QA。

色谱条件：参照葛雨萱等（2008）的方法，进样体积30uL，检测器波长320 nm。质谱条件：电喷雾离子化（ESI），离子阱分析器，正离子或负离子检测模式，全离子扫描，扫描范围100-700 Da，电喷雾接口干燥气（N2）流速1.5 L/min，毛细管电压4500 v，锥孔电压1600 v，干燥温度200℃，用仪器附带的LC/MSSolution 3.41分析质谱结果，根据保留时间、最大吸收波长及一级质谱分子离子峰得到的分子量计算出其元素组成，通过化学结构数据库（http：//www.chemspider.com/）检索得到可能的化学结构。

1.2.2花色物质类胡萝卜素提取及HPLC-MS分析参照蔡璇等（2010）的方法，称取1.0 g桂花花瓣，用10 mL丙酮：乙醇（1：1）溶液避光浸提3 h。参照郭琳琳（2007）的方法（有所改进）进行桂花类胡萝卜素花色物质HPLC-MS分析。先将上述得到的提取液在弱光或避光条件下进行皂化，将色素溶液旋转蒸发后溶于2 mL MTBE（含0.01%BHT），再加2 mL10%KOH-甲醇溶液（含0.01%BHT）充氮，避光条件下皂化10 h，加4 mL饱和NaCl水溶液和2 mL MTBE（含0.01%BHT）使之能更好地分层。将上清液真空浓缩后用1 mL MTBE（含0.01%BHT）溶解定容。定容后的提取液用微孔滤膜（0.45 pm）过滤，供高效液相色谱分析用。高效液相色谱质谱联用仪等装置及质谱条件同1.2.1。

色谱柱为日本维美希（YMC）公司的C30柱（250.0 mm×4.6 mm）。色谱条件：柱温35℃，流速1.0 mL/min，进样体积20uL，检测器波长450 nm。

1.2.3花色物质定量分析 对有标样的花色物质组分，利用外标法定量，大部分类黄酮组分取320 nm响应值定量，大部分类胡萝卜素组分取450 nm响应值定量。对未标样的组分，利用距离该组分峰保留时间最近的标样估算其相对含量。

1.2.4花色测量 3个花色桂花品种各取5个花序，从每个品种的每个花序中随机取6枚花瓣，用色差仪的集光孔对准花瓣中央测量其L*、a*、b*和C*，每枚花瓣测3次，取平均值。

1.3统计分析

试验数据采用SAS v8.0进行方差分析和多重比较。

2结果与分析

2.1类黄酮类花色物质的定性分析结果

从图2可看出，桂花花瓣中共鑒定出5种类黄酮化合物，分别标记为F1-F5。不同花色桂花品种的F1-F4出峰时间及其光谱图基本一致，但不同花色品种中各花色物质的含量存在差异，如F5在黄色花的柳叶金桂及黄白色花的厚瓣银桂中出峰明显，在橙色花的镉橙丹桂中出峰不明显。此外，3个品种中F2含量均最高，明显高于其他几种物质含量。说明在不同花色桂花品种中黄酮类物质的种类和含量有所不同。

由表1可知，在检出的5种黄酮化合物中，F2含量最高，其分子离子峰分别为m/z 579（[M-H]-）和m/z 301（[M-H-132-146]）。m/z 301（[M-H-132-146]。）可能是失去一个戊糖132和一个脱氧己糖146所得的碎片，因此，该组分可能是以槲皮素为母体色素的苷类物质；F5是明显存在于柳叶金桂和厚瓣银桂中的色素峰，在镉橙丹桂中难以检测到，其分子离子峰主要为m/z 435（[M+H]+）和m/z 273（[M+H-162]+），m/z 273（[M+H-162]+）可能是失去一个己糖所得的碎片，由此推论该色素可能是柚（苷）配基化合物；F1、F3和F4在3个花色桂花品种中含量均不高。F1的分子离子峰主要为m/z 371（[M+H]+）和m/z 287（[M+H-2×42]+），m/z 287（[M+H-2x42]+）可能是失去两个乙二醛所得的碎片，因此，初步判断F1为以金鱼草素为母体的色素物质；F3的分子离子峰主要有m/z 433（[M+H]+）和m/z 271（[M+H-162]+），m/z 271（[M+H-162]+）可能是失去一个己糖所得的碎片，因此，F3可能是含有芹菜素甙元的黄酮类色素物质；F4的主要离子碎片有m/z 340（[M+H]+）和m/z317（[M+H-23]+），m/z 317（[M+H-23]+）是失去一个钠所得的碎片，推断F4为含有鼠李金甙元的色素成分。综上所述，桂花花瓣中检测到的5种黄酮类物质可能为金鱼草素苷元、槲皮素苷元、芹菜素苷元、鼠李金苷元和柚皮素苷元。

2.2类胡萝卜素类花色物质的定性分析结果

从图3可看出，镉橙丹桂花瓣色素在450 nm波段明显有两个峰，而柳叶金桂和厚瓣银桂未在该波长内分离到相应的明显峰，说明柳叶金桂和厚瓣银桂中类胡萝卜素物质含量可能很低。对比Balder-mann等（2010）研究报道的丹桂品种中主要含a-胡萝卜素和B-胡萝卜素两种类型且占总类胡萝卜素物质含量在90%以上的结论，结合本研究中类胡萝卜素成分的特征吸收峰推断，镉橙丹桂中所检测到的类胡萝卜素物质C1为a-胡萝卜素，C2为B-胡萝卜素。

2.3花色物质的定量分析结果

根据质谱鉴定结果，用外标法进行定量分析，对无相同苷元标样的成分用出峰位置临近的标样代替。F1金鱼草素苷元选择绿原酸标样定量；F2槲皮素苷元选芦丁标样定量；F3芹菜素甙元选择芹菜素标样定量；F4鼠李金甙元选择芦丁标样定量；F5柚皮素苷元选择柚皮素标样定量。

由表2可知，在检测出的类黄酮类色素物质中，槲皮素苷元是3个桂花品种中含量最高的成分，且在镉橙丹桂花瓣中的含量（134.55 ug/gFW）显著高于厚瓣银桂和柳叶金桂（P<0.05，下同），厚瓣银桂的槲皮素苷元含量与柳叶金桂无显著差异（P>0.05，下同）；镉橙丹桂的金鱼草素苷元类色素物质含量为6.07 lag/gFw，显著高于其他两个品种；厚瓣银桂和柳叶金桂的柚皮素苷元类物质含量均较高，分别为13.98和15.00 ug/gFW，显著高于镉橙丹桂；3个品种的芹菜素苷元及鼠李金苷元含量无显著差异。

由表2还可看出，橙色的镉橙丹桂中检测到的a-胡萝卜素和B-胡萝卜素含量最高，分别为72.94和99.72 ug/gFW，显著高于另两个桂花品种；在黄白色的厚瓣银桂中检测到的a-胡萝卜素和B-胡萝卜素含量最低，分别为11.81和12.06ug/gFW；在黄色的柳叶金桂中检测到的a-胡萝卜素和B-胡萝卜素含量分别为24.84和27.90 ug/gFW。说明a-胡萝卜素和B-胡萝卜素是桂花中最主要的类胡萝卜素类物质，且主要存在于橙色花的丹桂品种中。

2.4花色物质组成与花瓣呈色的关系分析

由表3可知，花色由浅到深分别为黄白色、黄色和橙色，其相应的RHSCC（英国皇家园艺学会比色卡）变幅为2C-25B；3个桂花品种的L*变幅为65.51-73.18（其中，镉橙丹桂的L*最低，其他两个品种的L*均高于70.00），差异不明显；黄色花柳叶金桂的a*和b*均低于其他两个品种，黄白色花厚瓣银桂的C*在3个品种中最低。说明3个桂花品种颜色的鲜亮程度相似，而橙色镉橙丹桂比黄色柳叶金桂和黄白色厚瓣银桂的颜色更偏红或黄。

以花色测量值为因变量，花色物质组成含量为自变量，采用逐步筛选多元线性回归统计方法，分析桂花的花色物质组成与花瓣呈色的相关性，统计结果如下：

L*=-0.16707F2+87.98659（R=0.9990）

a*=0.25805C2-9.66094（R=0.9989）

b*=-0.80116F5+45.78575（R=0.9819）

可见，桂花的花色呈现与类黄酮化合物和类胡萝卜素化合物均有一定的关系。其中，L*与黄酮类化合物槲皮素苷元（F2）含量呈负相关，表明槲皮素苷元含量的增加可能使桂花花色变暗；a*与B-胡萝卜素（C2）含量呈正相关，表明B-胡萝卜素含量的增加可能是桂花花瓣呈现红色的关键；b*与类黄酮类物质柚皮素苷元（F5）含量呈负相关，表明柚皮素苷元含量的增加可能使桂花花瓣黄色变浅。说明槲皮素苷元、柚皮素苷元及B-胡萝卜素为桂花衰老过程中的特征花色物质。

2.5不同桂花品种开花过程中花色物质的变化

由表4可知，橙色镉橙丹桂的槲皮素苷元含量在其开花及衰老过程中呈先降低后升高的变化趋势，以初花期最低，为24.50 ug/gFW，而末花期最高，为224.81 ug/gFW，是初花期该物质含量的9倍多；柚皮素苷元含量较低，总体上呈缓慢上升趋势，在末花期时含量达最大值，为9.11 ug/gFW，而B-胡萝卜素含量在其开花及衰老过程中呈先升高后降低的变化趋势，在铃梗期时含量最低，为28.07 pg/gFW，在盛花期最高，为99.72 pg/gFW，在末花期下降为61.47 pg/gFW。

黄白色厚瓣银桂的槲皮素苷元含量在其开花及衰老过程中的变化趋势与镉橙丹桂相似。从铃梗期到初花期，槲皮素苷元含量从73.13 ug/gFW显著降至32.24ug/gFW，盛花期升高至89.41ug/gFW，末花期继续上升，达最大值（153.76 ug/gFW）；柚皮素苷元含量呈先缓慢上升后下降的變化趋势，铃梗期为4.73ug/gFW，初花期上升至5.92 ug/gFw，盛花期达最大值（13.98 ug/gFW），末花期下降至12.02ug/gFW；B-胡萝卜素含量在整个开花及衰老过程中基本上处于稳定状态。

黄色柳叶金桂的槲皮素苷元含量在其开花及衰老过程中呈先下降后上升的变化趋势，从铃梗期到初花期，其含量从94.25ug/gFW显著下降至36.45ug/gFW，盛花期迅速升高至90.39 ug/gFW，末花期达最大值（1 37.50 ug/gFW）；柚皮素苷元含量在整个开花及衰老过程中呈显著升高的变化趋势，初花期最低值为7.75 ug/gFW，末花期最高值为35.52 ug/gFW；B-胡萝卜素含量在开花及衰老过程中呈平缓上升后略下降的变化趋势，在盛花期达最大值（27.90ug/gFW），显著高于其他几个时期。

综上所述，与花色亮度值呈负相关的槲皮素苷元含量在3个不同花色品种桂花开花过程中均呈先降低后升高的变化趋势，与红色相关的B-胡萝卜素含量在镉橙丹桂开花过程中呈明显的先升高后降低趋势，与黄色相关的柚皮素苷元含量在柳叶金桂开花过程中呈缓慢上升趋势。这三类物质的变化规律共同决定了3个不同花色桂花品种开花过程中基本花色不产生明显变化，而花色明亮度随着花朵开放时间的推移呈先加深后变黯淡的特征。

3讨论

类黄酮是最广泛且成分十分丰富的花色物质，不同的类黄酮成分对花色形成的贡献不同。本研究从3个桂花品种花瓣中检测到的5种类黄酮类花色物质，可能为金鱼草素苷元、槲皮素苷元、芹菜素苷元、鼠李金苷元和柚皮素苷元等。其中，金鱼草素苷元因其最初在金鱼草中发现而得名，对亮黄色的呈现有重要贡献（Tanaka et al.，2008）；槲皮素苷元常以与葡萄糖或芸香糖结合的形式存在，已在腊梅等黄色花植物中检测到（葛雨萱等2008）。候丹（2014）从桂花中检测出8种类黄酮物质，其中定性分析出槲皮素、异鼠李素、丁香亭、芒柄花素等类黄酮物质。本研究与其检测出的类黄酮物质成分种类存在差异，可能是对黄酮类物质提取方法和检测条件不同引起。

多数类胡萝卜素类色素物质呈不同程度的黄色或红色，常见的类胡萝卜素类物质有番茄红素、六氢番茄红素、八氢番茄红素、紫黄质、玉米黄质、隐黄质、叶黄素、a-胡萝卜素和B-胡萝卜素等（Tanaka and Ohmiya，2008；Tanaka et al.，2008）。但许多植物的类胡萝卜素成分较单一，如宫灯百合（Sandersonia aurantiaca）中的类胡萝卜素主要为隐黄质、玉米黄质和B-胡萝卜素（Nielsen et al.，2003），万寿菊和菊花中的类胡萝卜素主要为叶黄素及其衍生物（Moehset al.，2001；Kishimoto et al.，2004）。本研究发现，橙色镉橙丹桂中的类胡萝卜素类物质主要是a-胡萝卜素和B-胡萝卜素，与Baldermann等（2010）、候丹（2014）的研究结果相似。

植物不同花色的呈现多与花器官中花色组分差异有关。张红磊（2011）研究认为，牡丹花的总花青素含量与L*呈极显著负相关，与a*呈极显著正相关，即随花青素化合物含量增加，花瓣的亮度降低，花色加深。洪艳等（2012）研究发现，菊花众多品种中粉红色系品种呈现的粉红色主要与花青素苷类中的矢车菊素苷含量有关，白黄色系品种中白黄色的呈现主要与类胡萝卜素含量相关。与上述研究结果不同，本研究中的桂花花瓣不含花色素苷，花色的呈现主要与类胡萝卜素和类黄酮化合物有关；a*与B-胡萝卜素含量呈正相关，即随着B-胡萝卜素含量的增加，桂花花瓣红色加深；b*在正数范围内与柚皮素苷元含量呈负相关，即随着柚皮素苷元含量的增加，桂花花瓣黄色变浅；槲皮素苷元含量与L*呈负相关，即随着槲皮素苷元含量的增加，桂花花瓣亮度降低。由此可见，不同物种花色的呈现，因其所含有的不同花色物质种类及含量水平而异。

4结论

槲皮素苷元、柚皮素苷元及B-胡萝卜素为桂花开花及衰老过程中的特征花色物质。与花色亮度值呈负相关的槲皮素苷元含量在3个不同花色品种桂花开花过程中均呈先降低后升高的变化趋势，与红色相关的B-胡萝卜素含量在镉橙丹桂开花过程中呈明显的先升高后降低趋势，与黄色相关的柚皮素苷元含量在柳叶金桂开花过程中呈缓慢上升趋势，这三类物质的变化规律共同决定了不同花色桂花品种开花过程中花色明亮度具有随着花朵开放时间推移呈先加深后逐步黯淡的特征，而基本花色不产生明显变化。