野生和人工培养红贝俄氏孔菌化学成分及抑菌活性测定

卢卫红　朱峰　吴善莹　洪茵

摘要：[目的]考察不同培养基对红贝俄氏孔菌乙酸乙酯提取物化学成分及抑菌活性的影响，为红贝俄氏孔菌的人工培养提供理论依据。[方法]分别用葡萄糖酵母膏蛋白胨培养基（GYP）和综合马铃薯培养基（CPDA）对红贝俄氏孔菌进行人工培养，采用乙酸乙酯提取菌丝体和发酵液化学成分，通过气相色谱一质谱联用技术（GC-MS）对比分析野生和人工培养红贝俄氏孔菌乙酸乙酯提取物的化学成分，通过微量稀释培养法评价野生菌和人工培养红贝俄氏孔菌乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性。[结果]GC-MS分析结果表明，野生菌和培养菌丝体乙酸乙酯提取物的主要成分为棕榈酸甲酯、棕榈酸和油酸等，其中，从野生菌检测出13种成分，含量较高的主要成分是亚油酸甲酯（18.522%）、棕榈酸甲酯（15.976%）和棕榈酸（11.164%）；产品GYP培养菌丝体共检出13种成分，含量较高的主要成分是棕榈酸（28.677%）、油酸（15.108%）和棕榈酸甲酯（8.983%）；从CPDA培养菌丝体共检出14种成分，含量较高的主要成分是棕榈酸甲酯（22.575%）、棕榈酸（17.643%）和硬脂酸甲酯（4.787%）；有7种相同成分共同存在于3种提取物中，有3种成分仅在野生菌中检测到，有7种成分仅在培养菌丝体中发现。从GYP培养液中共检出9种成分，含量较高的主要成分是十八甲基环壬硅氧烷（4.663%）、1-十九碳烯（2.423%）和（E）-3-十八碳烯（1.785%）；从CPDA培养液中共检出14种成分，含量较高的主要成分是棕榈酸（12.913%）、（z，E）-2，13-十八碳二烯-1-醇（5.985%）和棕榈酸甲酯（5.591%）。体外抑菌试验结果表明，GYP培养液提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强，其最低抑菌浓度（MIC）为0.80 mg/mL，其余提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC均为1.60 mg/mL。[结论]可采用GYP和CPDA作为培养基对野生红贝俄氏孔菌进行规模培养，以解决野生红贝俄氏孔菌资源不足的问题。

关键词：红贝俄氏孔菌；化学成分；气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）；抑菌活性

0引言

[研究意义]大多数木生真菌除了具有降解木质纤维素的功效外，还因含有多种活性成分而具有多种药用价值（戴玉成，2009；戴玉成和崔宝凯，2010）。红贝俄氏孑L菌[Earliella scabrosa（Pers.）Gilb.&Ryvarden]为木生菌，属多孔菌科（Polyporaceae）俄氏孔菌属（Earliella sp.），具有镇惊、活血、止血、疗风、止痒等药用功效（邓春英等，2013）。由于野生红贝俄氏孑L菌资源收集困难，目前对该菌的开发利用还非常有限。因此，研究利用人工培养物替代野生子实体进行红贝俄氏孔菌活性成分的开发利用具有重要现实意义。[前人研究进展]高等真菌化学成分因种类、菌株、培养基组成和菌龄的不同而有所差异，且菌丝体与子实体、菌盖与菌柄之间的化学成分也存在差异（姚秋生，2011）。在高等真菌培养条件研究方面，李德舜等（2008）以抗金黄色葡萄球菌活性为指标，对杨树菇液体发酵培养基和培养条件进行优化研究，获得了最佳培养基。冀瑞卿等（2012）经前期试验验证鹅膏菌菌株AV对杨树烂皮病病原菌金黄壳囊孢菌有抑制作用，通过比色法和生物量测定结果得出其抑菌物质产生的最佳营养条件。虫草素是蛹虫草的主要有效化学成分，其最佳培养基为以大米、玉米等作主料，另添加10%-25%的蚕蛹粉或奶粉提高蛹虫草子实体的品质（谭琪明，2014）。李羿等（2016）分别以营养培养基、药性培养基和复合药性培养基为初始发酵培养基，比较天然茯苓、發酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓等不同茯苓样品化学成分的差异，发现不同初始发酵培养基对茯苓液体发酵有较大影响，不同来源茯苓间的化学成分存在明显差异。目前有关红贝俄氏孔菌的研究主要集中在生物降解、抗菌活性和精油成分分析方面。Guem等（2008）、Lyra等（2009）研究发现，E.scabrosa对合成染料具有很好的脱色效果。Peng和Don（2013）通过摇瓶培养E scabrosa，发现其培养菌丝水提取物和甲醇提取物对受试橡胶树病原真菌表现出显著的抗真菌活性。岑婉莹等（2016）研究了野生红贝俄氏孔菌精油化学成分，发现该精油具有一定的抗氧化活性。[本研究切人点]迄今为止，尚未见关于野生和人工培养红贝俄氏孔菌化学成分及抑菌活性对比分析的研究报道。[拟解决的关键问题]分别用葡萄糖酵母膏蛋白胨培养基（GYP）和综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基（CPDA）对红贝俄氏孔菌进行人工培养，通过气相色谱一质谱联用技术（GC-MS）对比分析野生菌子实体、人工培养菌丝和培养液3种材料的乙酸乙酯提取物的化学成分，并采用肉汤微量稀释培养法评价各提取物的体外抑菌活性，考察人工培养对红贝俄氏孔菌化学成分和抑菌活性的影响，旨在为红贝俄氏孔菌人工培养物的开发利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

野生红贝俄氏孔菌子实体于2015年6月采自广东省佛山市南海区体育公园。通过组织分离法从新鲜野生菌子实体分离获得纯菌种。纯菌种用CPDA培养基（去皮马铃薯200 g，蛋白胨1 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，KH2PO4 3 g，MgS04 1.5 g，维生素B1 10mg，水1000 mL，pH 6.0）培养，保存于4℃冰箱。分析纯乙酸乙酯购自广州市番禺力强化工厂。主要仪器设备：RV8型旋转蒸发仪（德国IKA公司），气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）（型号7890A-5975C，美国安捷伦科技公司）。

1.2试验方法

1.2.1茵丝培养 将GYP培养基（葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，酵母膏2 g，KHzP04 1 g，水1000 mL，pH6.0）和CPDA培养基分别装入1000 mL三角瓶中，每种培养基各2瓶，每瓶300 mL。0.15 MPa灭菌30 min，冷却后通过无菌操作将菌种分别接种到三角瓶中，室温静置培养45 d。

1.2.2有效成分提取 培养物用纱布过滤，得菌丝体和培养液。菌丝体风干后用100 mL甲醇室温浸泡提取3次，每次24 h。合并甲醇提取液，合并液于50℃通过真空旋转蒸发，得到菌丝体浸膏。浸膏用乙酸乙酯溶解，硅胶短柱过滤，用乙酸乙酯充分洗脱。乙酸乙酯洗脱液于50℃下真空旋转蒸发，回收溶剂后剩余的洗脱物即为菌丝提取物，源于GYP培养基的菌丝提取物记为JSGYP，源于CPDA培养基的菌丝提取物记为JSCPDA。野生菌子实体按相同方法提取，得提取物记为FBWILD。

培养液分别用等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液合并后在50℃下真空旋转蒸发，回收乙酸乙酯后，得到培养液粗提物。粗提物用乙酸乙酯溶解，硅胶短柱过滤，用乙酸乙酯充分洗脱，乙酸乙酯洗脱液合并后在50℃下真空旋转蒸发，回收溶剂，剩余的洗脱物即为红贝俄氏孔菌培养液提取物，其中源于GYP培养基的培养液提取物记为FLGYP，源于CP-DA培养基的培养液提取物记为FLCPDA。

1.2.3 GC-MS分析 样品溶液：分别取一定量FBWILD、JSGYP、JSCPDA、FLGYP和FLCPDA共5种提取物，用乙酸乙酯溶解并配制成1 mg/mL样品溶液。采用GC-MS分析样品溶液化学成分。色谱条件：色谱柱采用J&w 122-0132DB-1ms石英毛细管柱（30 m×250um×0.25 Bm）；升温程序：起始温度65℃，恒温4 min，然后以40℃/min速度升温至280℃，恒温5 min；溶剂延迟：6.8 min；進样口温度：260℃，进样量1uL；载气为氦气。质谱条件：EI离子源，离子源温度220℃，电子能量70 eV，扫描范围50-550 m/z。定性定量方法：峰面积归一法。质谱数据库：美国NIST08.L谱库。

1.2.4体外抑茵活性试验 采用CLSI（2012）介绍的微量稀释培养法测定红贝俄氏孔菌5种提取物FBWILD、JSGYP、JSCPDA、FLGYP和FLCPDA体外对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureu）和大肠杆菌（Escherichia coli）的抑制作用，以兽用链霉素和青霉素为对照。操作步骤：（1）制作供试菌菌悬液：将供试细菌接种于M-H肉汤培养基中，于室温下静置培养18-24 h，获得细菌悬液，用M-H肉汤培养基将细菌悬液稀释成106 CFU/mL接种液。（2）配制抑菌药液：用二甲基亚砜溶液分别将5种红贝俄氏孑L菌提取物和对照药品溶解并配制成起始浓度为12.80 mg/mL的药液（参照物初始浓度为1.28 mg/mL），用针头滤器滤菌备用。（3）96微孔板的准备：选用无菌96微孑L板，外围孔中加200uL无菌水，其余孔中加100uL M-H肉汤培养基；将滤菌后的药液100uL加到各行的第1孔中，用移液枪吸打混匀，再将稀释后的药液100uL移入第2孔中，如此反复，对药液进行倍半稀释，使不同孔中药液浓度范围为6.40-0.025 mg/mL；最后向每一检测孔中均加入接种液100uL。（4）抑菌培养：将培养板置于36 ℃孵育18 h，再向每孔加入20uL对碘硝基四唑紫（INT），继续孵育1 h，观察孔内溶液的颜色变化，粉红色的板孔为阳性生长，最低抑菌浓度（MIC）定义为阻止颜色变为粉红色的最低药物浓度。试验重复3次。

2结果与分析

2.1红贝俄氏孔菌野生子实体和培养菌丝化学成分对比分析结果

从3.38 g风干野生菌子实体得到膏状提取物FBWILD 0.11 g，提取率为3.25%；从600 mL GYP培养基获得的2.88 g风干菌丝体得到膏状提取物JSG-YP 0.14 g，提取率为4.86%；从600 mL CPDA培养基获得的2.96 g风干菌丝体得到膏状提取物JSCPDA0.14 g，提取率为4.73%。

采用GC-MS分析FBWILD、JSGYP和JSCPDA的化学成分得到总离子流色谱图（图1）。从FBWILD分离获得59个组分，通过NIST08.L谱库检索，共检出13种化学成分，占总油量的74.943%，其主要成分分别为亚油酸甲酯（18.522%）、棕榈酸甲酯（15.976%）、棕榈酸（11.164%）、油酸（7.660%）和苯甲酸（5.330%）；从JSGYP分离获得50个组分，通过NIST08.L谱库检索，共检出13种化学成分，占总油量的74.886%，其主要成分分别为棕榈酸（28.677%）、油酸（15.108%）、棕榈酸甲酯（8.983%）、硬脂酸（6.626%）和油酸甲酯（4.160%）；从JSCPDA分离获得61个组分，通过NIST08.L谱库检索，共检出14种化学成分，占总油量的65.131%，其主要成分分别为棕榈酸甲酯（22.575%）、棕榈酸（17.643%）、硬脂酸甲酯（4.787%）、硬脂酸（4.277%）和油酸（3.861%）（表1）。

由图1和表1可知，FBWILD、JSGYP和JSCPDA的化学组成不完全相同，但大多数化学成分相同，只是含量发生了变化，如棕榈酸在野生菌中含量为11.164%，在GYP培养菌丝中含量为28.677%，在CPDA培养菌丝中含量为17.643%。分析已鉴定出的化学成分发现，在3种样品中均检测到十五碳酸甲酯、棕榈酸甲酯、棕榈酸、珠光脂酸甲酯、亚油酸甲酯、油酸和硬脂酸等7种化合物，其中棕榈酸甲酯、棕榈酸和油酸是3种样品共同的主要成分；十五碳酸只存在于FBWILD和JSGYP中，2-十一烷酮、油酸甲酯和（10反，12顺）-十八碳二烯酸甲酯只存在于人工培养菌丝中；苯甲酸、9-甲基肉豆蔻酸甲酯和珠光脂酸只在野生菌子实体中检测到，2-羟基硬脂酸甲酯和肉豆蔻酸甲酯只在JSCPDA中检测到，十九碳烷和二十八碳烷仅在JSGYP中检测到。

2.2红贝俄氏孔菌培养液化学成分对比分析结果

采用GYP和CPDA两种培养基对红贝俄氏孔菌进行人工培养。从600 mL GYP培养液获得的1.66 g粗提物中得到膏状洗脱物FLGYP 0.44 g，产量0.73mg/mL。从600 mL CPDA培养液获得的1.34 g粗提物中得到洗脱物FLGYP 0.37 g，产量0.62 mg/mL。

用GC-MS分析FLGYP和FLCPDA的化学成分得到总离子流色谱图（图2）。从FLGYP分离获得68个组分，通过NIST08.L谱库检索，共检出9种化学成分，占总油量的14.361%，其中含量较高的成分依次为十八甲基环壬硅氧烷（4.663%）、1-十九碳烯（2.423%）、（E）-3-十八碳烯（1.785%）、棕榈酸甲酯（1.642%）和十八烷基2，2，2-三氯乙基碳酸酯（1.546%）；从FLCPDA分离获得63个组分，通过NIST08.L谱库检索，共检出14种化学成分，占总油量的47.485%，其主要成分分别为棕榈酸（12.913%）、（Z，E）-2，13-十八碳二烯-1-醇（5.985%）、棕榈酸甲酯（5.591%）、亚油酸甲酯（4.492%）和1-十九碳烯（3.420%）（表2）。

由图2和表2可知，FLGYP和FLCPDA的化学组成有明显差异。FLGYP的化学成分更丰富，有68个组分，而FLCPDA只有63个组分。分析已鉴定出的化学成分发现，在FLGYP和FLCPDA中均检测到棕榈酸甲酯、棕榈酸、棕榈酸乙酯、1-十九碳烯、十八烷基2，2，2-三氯乙基碳酸酯和2，4-二（1-甲基-1-苯基乙基）苯酚，但含量发生了变化，如棕榈酸在GYP培养中含量为0.322%，而在CPDA培养液中为12.913%；（E）-3-十八碳烯、十八甲基环壬硅氧烷和（E）-1，3，3-三甲基-2-（3-甲基-2-亚甲基-3-丁烯叉）環己醇只存在于FLGYP中；十七碳烷、十五碳酸甲酯、3，5-二叔丁基-4-羟基苯丙酸甲酯、亚油酸甲酯、亚油酸、（Z，E）-2，13-十八碳二烯-1-醇、7，11-十六碳二烯醛和1-二十四碳醇只在FLCPDA中检测到。

2.3体外抑菌活性测定结果

红贝俄氏孔菌5种不同提取物体外对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性测定结果（表3）表明，5个样品均有一定的抑菌活性，其中FLGYP的抑菌活性最强，对金黄色葡萄球菌的MIC为0.80 mg/mL，其余样品对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC均为1.60 mg/mL。

3讨论

高等真菌的生长及其化学成分受碳源、氮源等因素的影响（谭琪明，2014；杨培新等，2015），获得高等真菌产活性物质的最佳培养条件是驯化野生真菌的关键，而GC-MS在易挥发化学成分分析中应用广泛（岑婉莹等，2016），因此采用GC—MS可快速准确地分析不同培养基下红贝俄氏孔菌子实体和培养液易挥发化学成分。

本研究通过GYP和CPDA两种培养基对野生红贝俄氏孔菌菌丝进行人工培养，结果该菌在供试两种培养基中长势良好，从600 mL GYP培养基中获得风干菌丝2.88 g，产量4.80 mg/mL，从600 mL CPDA培养基中获得风干菌丝2.96 g，产量4.93 mg/mL。另外，从人工培养菌丝获得的洗脱物获得率分别为4.86%（JSGYP）和4.73%（JSCPDA），均高于从野生菌子实体获得的洗脱物FBWILD获得率（3.25%），特别是从培养液中还获得了该菌的次级代谢粗提物，从600 mL GYP培养液获得粗提物1.66 g，产量2.77mg/mL，从600 mL CPDA培养液中获得粗提物1.34 g，产量2.23 mg/mL。

GC-MS分析结果表明，人工培养菌丝和野生菌子实体的化学组成不完全相同，而且含量发生了明显变化。如棕榈酸甲酯在野生菌子实体中的含量为15.976%，但在人工培养菌丝中的含量分别为8.983%（GYP培养基）和22.575%（CPDA培养基）。一些存在于野生菌子实体中的化学成分如苯甲酸在人工培养菌丝中未能发现，但在人工培养菌丝中发现了野生菌子实体不存在的化学成分，特别是从人工培养液中获得了丰富的次级代谢产物，大部分次级代谢产物在野生菌子实体或人工培养菌丝中均未得到。对FLGYP和FLCPDA的GC-MS分析表结果明，培养基不同，其次级代谢产物也不完全相同。本研究通过GC-MS只鉴定出了供试5个洗脱物中的少数化学成分，大多数化学成分未能得到鉴定，仍需要进一步通过分离纯化，结合NMR等技术加以解析。

体外抑菌试验结果表明，红贝俄氏孔菌不同提取物FBWILD、JSGYP、JSCPDA、FLGYP和FLCPDA对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有一定的抑菌活性，其中FLGYP的抑菌活性最强，对金黄色葡萄球菌的MIC为0.80 mg/mL，其余样品对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC均为1.60 mg/mL，说明这些样品中可能含有相同的抑菌活性成分，但FLGYP对金黄色葡萄球菌的抑菌活性更强，说明FLGYP中可能还含有其他抑菌活性成分。

由于GC-MS只能通过与NIST谱库中已知化合物质谱数据对比以鉴定样品中的化合物，对于样品中含有但NIST谱库中未记录的化合物尚未能得到鉴定。同时，样品中的高沸点化合物也不能通过GC-MS进行鉴定。因此，红贝俄氏孔菌中可能存在其他未知的抗菌活性成分，有待通过规模培养，采用现代分离纯化技术获得足够量的单体化合物，然后进一步通过核磁共振波谱、高分辨质谱等技术加以结构解析。

4结论

运用GC-MS分析红贝俄氏孔菌野生菌子实体、人工培养菌丝体和培养液乙酸乙酯提取物的化学成分，并通过NIST08.L谱库检索鉴定样品中的化合物，结果表明，GYP和CPDA培养获得的菌丝体与野生菌子实体的化学组成不完全相同，主要成分均为棕榈酸、棕榈酸甲酯和油酸等，但含量存在差异；从人工培养获得的培养液中可获得丰富的次级代谢产物，主要成分均为棕榈酸甲酯和棕榈酸，但在不同培养条件下各培养液中的次级代谢产物存在差异。体外抑菌活性试验结果表明，红贝俄氏孔菌人工培养菌丝提取物及野生菌子实体提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现出抑制活性。因此，可采用GYP和CPDA为培养基对野生红贝俄氏孔菌进行规模培养，以解决野生红贝俄氏孔菌资源不足的问题。