利拉鲁肽对糖尿病模型大鼠肾脏组织核因子-κB、单核细胞趋化蛋白-1和血管细胞间黏附分子-1表达的影响

兴桂华 张 健 何 静 孙筱竹 付永丽

(齐齐哈尔医学院临床病理诊断中心，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

利拉鲁肽对糖尿病模型大鼠肾脏组织核因子-κB、单核细胞趋化蛋白-1和血管细胞间黏附分子-1表达的影响

兴桂华 张 健1何 静1孙筱竹1付永丽1

(齐齐哈尔医学院临床病理诊断中心，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

目的 探讨利拉鲁肽对糖尿病(DM)大鼠肾脏组织核因子(NF)-κB、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1和血管细胞间黏附分子(VCAM)-1表达的影响。方法 选用8周龄雄性SD大鼠54只，随机分为正常对照组、模型组、胰岛素对照组和利拉鲁肽低、中、高剂量组(100、200和300 μg·kg-1·d-1)，采用高脂高糖饲料喂养大鼠4 w后，再给予链脲佐菌素(STZ)35 mg/kg腹腔注射建立动物模型。药物干预8 w后测定血糖、血肌酐和尿素氮等生化指标改变。采用免疫组织化学SP方法和病理图像定量分析技术检测大鼠肾组织NF-κB、MCP-1和VCAM-1的表达水平。结果 与模型组相比，胰岛素对照组及利拉鲁肽各剂量组大鼠血肌酐、血尿素氮、尿白蛋白/肌酐均明显降低(P<0.01)；与模型组相比，利拉鲁肽各剂量组肾组织NF-κB、MCP-1和VCAM-1的表达降低(P<0.05)。结论 利拉鲁肽通过下调DM大鼠肾脏组织NF-κB、MCP-1和VCAM-1表达，发挥对肾小球毛细血管内皮细胞的保护作用，从而改善DM大鼠肾损伤。

利拉鲁肽；糖尿病；单核细胞趋化蛋白；血管细胞间黏附分子；核因子-κB

糖尿病(DM)肾病(DN)是DM并发症之一，有极高的致残率和致死率。研究证实〔1〕，胰高血糖素样肽(GLP)-1可改善DM患者血管内皮功能。GLP-1受体激动剂利拉鲁肽是副作用较少的、新型的治疗DM的药物，研究发现，利拉鲁肽治疗可延缓DM患者肾损伤的进展〔2〕。本课题组成功建立DM动物模型，应用利拉鲁肽干预治疗后，通过免疫组化方法检测核因子(NF)-κB、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1和血管细胞间黏附分子(VCAM)-1的表达，观察利拉鲁肽除降糖作用外是否对DM模型大鼠肾小球毛细血管内皮细胞具有保护作用，从而探讨利拉鲁肽改善DM大鼠肾损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：雄性8周龄SD大鼠54只，体重180～200 g，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证编号SCXK(吉)2014-0004。药物与主要试剂：链脲佐菌素(STZ)购于Sigma，USA；利拉鲁肽注射液购于诺和诺德(中国)制药有限公司；大鼠胰岛素试剂盒购自美国Linco公司。兔抗鼠MCP-1、NF-κB和VCAM-1多克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司，免疫组化SP法检测试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。主要仪器：罗氏血糖仪(ACCU-CHEK，USA)，日立7020型全自动生化分析仪(日本日立公司)，离心机(Hamburg)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模 大鼠适应性饲养1 w后随机分为正常对照组、模型组、胰岛素对照组和利拉鲁肽低、中、高剂量组，每组9只。造模方法：将大鼠适应性喂养1 w后，模型组大鼠给予高脂高糖饲料喂养4 w后，再给予STZ 35 mg/kg腹腔注射，建立DM大鼠模型，胰岛素对照组给予地特胰岛素3～5 IU/d皮下注射，利拉鲁肽低、中、高剂量组分别腹部皮下注射100、200、300 μg·kg-1·d-1；模型组及正常对照组给予生理盐水3～5 ml/d皮下注射；共计干预8 w。

1.2.2 指标检测 实验结束前1 d，每组取9只大鼠，代谢笼收集24 h尿液，计数24 h尿量，采用免疫比浊法测定24 h微量白蛋白；所有大鼠禁食12 h，从眼外眦处取空腹血，采用自动生化分析仪检测血尿素氮和肌酐。

1.2.3 NF-κB、MCP-1和VCAM-1免疫组化检测 随机选9只大鼠断头处死，迅速取出肾组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片厚约3 μm。采用免疫组化SP方法，严格按试剂说明书进行操作，主要操作步骤：滴加兔抗鼠多克隆抗体MCP-1、兔抗鼠多克隆抗体NF-κB和兔抗鼠多克隆抗体VCAM-1，4℃冰箱过夜。滴加生物素化二抗工作液37℃孵育20 min。滴加链霉卵蛋白37℃孵育20 min。DAB显色。苏木素复染，中性树胶封片。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。光镜下观察，并用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统分别进行NF-κB、MCP-1和VCAM-1半定量评分〔3〕：每张切片随机选取10个肾小球，在高倍镜(×400)视野下阳性表达呈棕褐色。NF-κB、MCP-1和VCAM-1表达水平采取阳性染色面积评分与阳性染色强度评分的乘积表示。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析、SNK检验。

2 结 果

2.1 利拉鲁肽对DM模型大鼠肾功能和尿白蛋白/肌酐的影响 利拉鲁肽干预8 w后，与正常对照组相比，模型组血肌酐、血尿素氮和尿白蛋白/肌酐均显著增加(P<0.05)；与模型组相比，利拉鲁肽各剂量组和胰岛素对照组血肌酐、血尿素氮、尿白蛋白/肌酐均降低(P<0.05)，见表1。

表1 利拉鲁肽对DM模型大鼠肾功能和尿白蛋白/肌酐的影响

与正常对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；下表同

2.2 利拉鲁肽对DM模型大鼠肾脏组织NF-κB、MCP-1和VCAM-1表达的影响 免疫组化结果显示，与正常对照组相比，模型组大鼠肾组织毛细血管内皮NF-κB、MCP-1和VCAM-1表达均升高；与模型组相比，胰岛素对照组及利拉鲁肽各剂量组NF-κB、MCP-1和VCAM-1表达明显减少(P<0.05)。见表2。

表2 利拉鲁肽对DM模型大鼠肾脏组织MCP-1、NF-κB和VCAM-1表达的影响

3 讨 论

DN是目前引起终末期肾衰竭的主要原因〔4〕。有研究认为，DM是一种慢性炎性反应疾病，炎性因子在DN的发生发展中发挥着重要作用〔5〕。NF-κB是一种重要的核转录因子，参与体内多种基因的调控和转录，在DN中发生发展的作用日益引起重视。最新研究显示，高糖诱导下2型DM大鼠肾组织中NF-κB 活性增强进一步加剧了肾损伤，并且通过激活NF-κB可诱导血管内皮细胞表达MCP-1〔6〕。MCP-1作为NF-κB的下游细胞因子，是一种特异性的单核/巨噬细胞趋化因子，在DN 发病机制中起重要作用〔7〕。近年来的研究〔8〕显示MCP-1与DM微血管病变密切相关，DN中单核/巨噬细胞的广泛浸润可引起细胞外基质堆积、基底膜增厚，从而发展为肾小球硬化和间质纤维化，某些抗MCP-1措施可减轻DM肾损伤。VCAM-1 属黏附分子中免疫球蛋白超家族成员，VCAM-1 基因的表达主要由转录因子NF-κB 控制，VCAM-1与整合素家族的迟出现的抗原(α4β1)结合后，导致构型改变，都成为高亲和力的黏附分子，从而处于活化状态。已往有研究表明，VCAM-1与DM及其慢性并发症密切相关〔9〕。

近年来，DN的标准治疗主要包括阻断肾素血管紧张素系统控制血压及控制血糖。利拉鲁肽是副作用较少的、新型的治疗DM的GLP-1类似药物，具有降血糖、抑制胰高血糖素、延缓胃排空及减轻体质量等作用〔2〕。研究表明，利拉鲁肽在改善DM大鼠血管内皮功能方面优越于传统降糖药〔10〕。新近研究发现，利拉鲁肽可抑制胰岛素抵抗大鼠肾组织NF-κB、肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6的表达，可能参与肾功能改善〔11〕。本实验结果表明利拉鲁肽可能通过下调DM大鼠肾组织MCP-1和NF-κB的表达，从而改善DM微血管病变。另外本研究还表明利拉鲁肽可能通过降低肾组织VCAM-1的表达，以发挥对DM模型大鼠肾脏的保护作用。

1 Hu Y，Liu H，Simpson RW，etal.GLP-1-dependent and independent effects and molecular mechanisms of a dipetidyl peptidase 4 inhibitor in vascular endothelial cells〔J〕.Mol Biol Rep，2013；40(3)：2273-9.

2 Imamura S,Hirai K，Hirai A.The glucagon-like peptide-1 receptor agonist，liraglutide，attenuates the progression of overt diabetic nephropathy in type 2 diabetic patients〔J〕.Tohoku J Exp Med，2013；231(1):57-61.

3 李 颖，夏 天，李 荣.吡格列酮对KKAy小鼠肾脏的保护作用及其机制探讨〔J〕.中华糖尿病杂志，2015；10(7)：639-44.

4 Zhou G，Li C,Cai L.Advanced glycatiod end-products induce connective tissue growth factor-mediated renal fibrosis predominantly through transforming growth factor beta-independent pathway〔J〕.Am J Pathol，2004；165：2033-43.

5 Navarro-Gonzalez JF，Mora-Fernandez C.The role inflammatory cytokines in diabetic nephyropathy〔J〕.J Am Soc Nephrol，2008；19：433-42.

6 Fujii T，Yonemitsu Y，Onimaru M，etal.Nonendothelial mesenchymal cell derived MCP-1 is required for FGF2 mediated therapeutic neovascularization：critical role of the inflammatory/arteriogenic pathway〔J〕.Arterioseler Thromb Vasc Biol，2006；26(11)：2483-9.

7 Giunti S，Barutta F，Perin PC，etal.Targeting the MCP-1/CCR2 system in diabetic kidney disease〔J〕.Curr Vasc Pharmacol，2010；8(6)：849-60.

8 Tone A，Shikata K，Nakagawa K，etal.Renoprotective effects of clarthromycin via reduction of urinary MCP-1 levels in type 2 diabetic patients 〔J〕.Clin Exp Nephrol，2011；15(1)：79-85.

9 Fasching P，Voitl M.Elevated concentrations of circulating adhesion molecules ane their association with microvascular complacation in insulin-dependent diabetes mellitus〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，1996；81：4313-7.

10 綦才辉，金勇君，杨美子，等.利拉鲁肽对2型糖尿病大鼠NF-κB及VCAM-1表达的影响〔J〕.山东大学学报(医学版)，2014；52(4)：39-42.

11 吴晓静，胡桂才，高 宇，等.利拉鲁肽对胰岛素抵抗大鼠肾脏NF-κB及炎症因子表达的影响〔J〕.实用医学杂志，2016；32(18)：3000-3.

〔2016-11-09修回〕

(编辑 李相军/滕欣航)

齐齐哈尔市科技计划项目(No.SFGG-201524);齐齐哈尔医学院院内科研基金项目(QY2016M-04)

张 健(1968-)，女，主任医师，教授，主要从事糖尿病临床药物治疗研究。

兴桂华(1969-)，女，硕士，主任医师，教授，主要从事糖尿病肾病的基础研究。

R587.1

A

1005-9202(2017)09-2119-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.016

1 齐齐哈尔医学院附属第二医院内分泌科