幽门螺杆菌感染对十二指肠黏膜上皮细胞碳酸氢盐转运蛋白表达的影响

邓时莉 金 海 文国容 庹必光

(遵义医学院附属医院消化内科，贵州 遵义 563003)

幽门螺杆菌感染对十二指肠黏膜上皮细胞碳酸氢盐转运蛋白表达的影响

邓时莉 金 海 文国容 庹必光

(遵义医学院附属医院消化内科，贵州 遵义 563003)

目的 探究幽门螺杆菌(HP)感染对小鼠十二指肠上皮细胞碳酸氢盐转运蛋白表达的影响。方法 C57小鼠随机分为四组，三组分别给予HP菌株SS1、NCTC11637、NCTC11639感染，一组仅给予同等量的磷酸盐缓冲液(PBS)灌胃(对照组)，2 w后收集组织。体外培养十二指肠上皮细胞，与HP菌株共培养，其中对照组给予等量PBS干预，收集细胞。应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)及Western印迹检测组织及细胞中碳酸氢盐转运蛋白表达的影响。结果 HP感染小鼠后，由吉姆萨染色镜检见，感染后可见大量紫蓝色小体，呈逗点状、短棒状；细胞实验：HP菌株NCTC11637与十二指肠上皮细胞共培养后应用RT-PCR扩增HP16srRNA，小鼠及细胞实验均目的基因为单一扩增，扩增良好。小鼠及细胞实验均3种HP菌种囊性纤维跨膜传导调节因子(CFTR)、离子交换体(SLC)26A3及SLC26A6感染2 w后，碳酸氢盐转运蛋白mRNA及蛋白表达显著低于对照组(P<0.05)。结论 从体内到体外，HP可通过调控碳酸氢盐转运蛋白含量来干预疾病的进展。

幽门螺杆菌；十二指肠溃疡；碳酸氢盐转运蛋白；囊性纤维跨膜传导调节因子(CFTR)；离子交换体(SLC)26A3；SLC26A6

十二指肠溃疡主要的致病因素是幽门螺杆菌(HP)感染，其是通过细菌和宿主共同作用诱发疾病。HP侵袭肠黏膜上皮细胞，侵害黏膜自身防御和碳酸氢盐修复平衡，从而诱发溃疡疾病〔1〕。多种碳酸氢盐转运蛋白，如囊性纤维跨膜传导调节因子(CFTR)、离子交换体(SLC)26A3、26A6可通过干预碳酸氢盐分泌参与肠黏膜上皮细胞正常调控，从而减弱胃肠分泌物及蛋白酶对消化系统的损害〔2〕。HP提取物可抑制肠黏膜上皮细胞碳酸氢盐分泌，提示HP可能参与碳酸氢盐转运蛋白合成过程〔3〕。本实验通过体内和体外试验阐明HP感染肠黏膜上皮细胞的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2013年6～11月遵义医学院附属医院内镜科检查患者20例取正常十二指肠球部黏膜组织，男11例，女9例，年龄34～58岁。HP标准株SS1、NCTC11637、NCTC11639购于中国疾病预防控制中心。

1.2 主要试剂 RNAiso Plus及Prime ScriptTMRT Reagent Kit试剂购于TaKaRa宝生物公司；iQTM SYBR Green Supermix购于Bio-Rad公司；吉姆萨(Giemsa)染液购于贵阳恒因公司；CFTR、SLC26A3、SLC26A6抗体购于CST公司，引物设计由宝生物公司完成。

1.3 HP感染小鼠模型 30只雄性C57BL/6J小鼠(购自北京维通利华公司)，6～7周龄，18～20 g体重，随机分为实验组和对照组各15只。HP培养3 d后，灭菌后调整浓度为1×109CFU/ml，0.5 ml灌胃，对照组给予同等剂量磷酸盐缓冲液(PBS)灌胃，2 d/次，共4次。分别予HP灌胃2 w时采集十二指肠近心端0.3 cm长肠段，-80℃保存后备用。同时取胃标本，进行感染程度鉴定。对照组给予同等剂量PBS灌胃。

1.4 吉姆萨染色 取模型十二指肠及胃标本的黏膜直接涂片，然后滴入吉姆萨染液，作用8 min，冲去多余浮色后，显微镜观察并拍片。采用修订好的悉尼标准进行十二指肠HP感染密度判定：无，标本未见HP；轻度，小于标本全长的1/3有少量HP浸润；中度，标本全长的1/3～2/3有HP浸润；重度，HP大量存在，浸润达标本全长。

1.5 mRNA 表达检测 引物序列见表1。所需器械均经高压去RNA酶处理，并经0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理，且实验均在冰块上操作，降低温度对结果的影响。取保存的十二指肠段，加入1 ml TRIZOL，应用匀浆机裂解5 min；取培养好的肠上皮细胞，加入1 ml TRIZOL裂解5 min。然后依次加入三氯甲烷、异丙醇及75%乙醇进行获取RNA，10 μl DEPC水溶解RNA沉淀，紫外分光光度仪测定浓度及纯度。应用逆转录试剂盒，严格按照说明书，将提取的RNA逆转录为cDNA，并严格按照扩增试剂反应要求，进行PCR体系的扩增及反应，并进行琼脂糖凝胶电泳。

表1 用于扩增的各基因引物序列

1.6 蛋白印迹实验 取培养后的肠黏膜细胞，加入含1%苯甲基磺酰氨(PMSF)的蛋白裂解液，12 000 r/min，4℃，离心30 min取上清，应用蛋白定量检测蛋白浓度后，将各样品浓度配齐，并加入上样缓冲液煮沸变性。上样跑胶，转膜，封闭，加CFTR，SLC26A3，SLC26A6及内参β-actin一抗4℃过夜，第2天辣根过氧化物酶二抗常温孵育2 h，在暗室内进行显影定影，结果应用Image-plus软件测量灰度值。

1.7 十二指肠上皮细胞原代培养 清洗十二指肠黏膜后，将组织剪碎放入0.5 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)的RPMI1640培养基(NRM)溶液中，充分摇匀。取组织碎片，加入含酶的NRM溶液，37℃水浴，终止消化后离心取细胞沉淀，应用含20 ng/ml的表皮生长因子及0.2 U/ml的胰岛素的DMEM/F12培养基培养。选取HP菌株培养72 h收获，刮取菌落，混于灭菌PBS混匀，加入十二指肠上皮细胞培养液中，按细菌细菌和细胞数量比为的比为100∶1培养，混合培养24 h后收集细胞备用。其中对照组予等量PBS溶液干预。

1.8 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 小鼠HP感染的鉴定 胃窦黏膜切片，由吉姆萨染色镜检见，HP感染后可见大量紫蓝色小体，呈逗点状、短棒状，见图1；取胃窦黏膜组织，应用RT-PCR扩增HP 16srRNA，可见，目的基因为单一扩增，扩增良好，退火温度为60℃，其中扩增曲线、溶解曲线及溶解曲线峰图见图2。

图1 小鼠胃窦黏膜HP感染鉴定

2.2 HP感染对小鼠碳酸氢盐转运蛋白mRNA的影响 应用RT-PCR检测HP感染2 w后CFTR、SLC26A3、SLC26A6的表达变化。CFTR、SLC26A3及SLC26A6均为单一扩增，扩增良好，且与对照组相比，3种菌株CFTR、SLC26A3及SLC26A6 mRNA表达显著低于对照组(均P<0.05)，见表2，图3。

2.3 HP感染对小鼠碳酸氢盐转运蛋白的影响 应用Western印迹检测HP感染2 w后CFTR、SLC26A3、SLC26A6的表达变化。与对照组相比，3种菌株CFTR、SLC26A3及SLC26A6蛋白表达显著低于对照组(P<0.05)，见图4。

图2 小鼠16srRNA的扩增曲线、溶解曲线及溶解曲线峰图

2.4 HP感染小鼠模型定值密度 各型菌株感染小鼠模型，其定值密度无明显差异(P>0.05)，见表3。因此随机选取标准菌株NCTC11637进行后续细胞实验。

2.5 原代培养的十二指肠上皮细胞培养 正常培养的十二指肠上皮细胞，以取出细胞开始培养为0 h，24～48 h细胞开始贴壁，7～8 d细胞开始增殖，10～14 d时细胞开始融合，见图5。取十二指肠上皮细胞，应用RT-PCR扩增HP 16srRNA，可见，目的基因为单一扩增，扩增良好，退火温度为60℃，其中扩增曲线，溶解曲线及溶解曲线峰图见图6。

2.6 HP感染对十二指肠上皮细胞碳酸氢盐转运蛋白mRNA的影响 应用RT-PCR检测HP与十二指肠上皮细胞共培养24 h后CFTR、SLC26A3、SLC26A6 mRNA的表达变化。与对照组相比，NCTC11637菌株CFTR、SLC26A3及SLC26A6 mRNA表达显著低于对照组(P<0.05)，见表4。

2.7 HP感染对十二指肠上皮细胞共培养24 h后碳酸氢盐转运蛋白的影响 与对照组相比，3种菌株CFTR、SLC26A3及SLC26A6蛋白表达显著低于对照组(均P<0.05)，见图7。

表2 HP感染小鼠后2 w碳酸氢盐转运蛋白mRNA的表达水平

与对照组比较：1)P<0.05；表4同

表3 各菌株HP感染小鼠定值密度分析〔n(%),n=12〕

图3 HP感染小鼠后2 w CFTR、SLC26A3、SLC26A6 mRNA的表达水平

图4 HP感染小鼠后2 w碳酸氢盐转运蛋白的表达水平

图5 原代培养正常十二指肠黏膜上皮细胞

图6 原代培养的人16srRNA的扩增曲线、溶解曲线及溶解曲线峰图

组别CFTRSLC26A3SLC26A6对照组339±011179±071169±019实验组031±0011)059±0211)061±0101)

图7 HP与十二指肠黏膜上皮细胞共培养24 h后碳酸氢盐转运蛋白的表达水平

3 讨 论

1 高 文,胡伏莲,成 虹，等.国产药物组成的四联疗法对胃炎及十二指肠溃疡患者幽门螺杆菌感染根除效果的前瞻性多中心随机对照研究〔J〕.中华医学杂志,2016；96(4):260-4.

2 Tarnawski AS，Ahluwalia A，Jones MK.Increased susceptibility of aging gastric mucosa to injury：the mechanisms and clinical implications〔J〕.World J Gastroenterol，2014；20(16)：4467-82.

3 Henriksnäs J，Phillipson M，Storm M，etal.Impaired mucus-bicarbonate barrier in Helicobacter pylori-infected mice〔J〕.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2006；291(3)：G396-403.

4 张江兰，邢琛琨，任君旭，等.肠三叶因子与胃溃疡关系的研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(5)：1420-2.

5 王 慧，许惠玉，官 杰，等.真人养脏汤对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜sIgA、γδT细胞和超微结构的影响〔J〕.中国老年学杂志，2016；36(7)：1565-7.

6 方健松，马媛萍，刘 畅，等.自噬介导肠黏膜屏障维持肠道稳态在炎症性肠病中的作用〔J〕.实用医学杂志，2016；32(8)：1367-9.

7 陈思羽，黄会云，陈 玉，等.肠屏障功能障碍及cingulin、claudin-2表达变化在溃疡性结肠炎中的作用〔J〕.胃肠病学和肝病学杂志，2016；25(1)：43-6.

8 沈 飞，冀子中，陈淑洁，等.铝碳酸镁对实验性胃溃疡的疗效及其机制探讨〔J〕.胃肠病学，2016；21(3)：151-5.

9 Megala J，Geetha A.Effect of pithecellobium dulce benth fruit extract on cysteamine induced duodenal ulcer in rats〔J〕.Indian J Exp Biol，2015；53(10)：657-64.

10 Gujral T, Kumar A, Priyamvada S,etal.Mechanisms of DRA recycling in intestinal epithelial cells: effect of enteropathogenic E. coli〔J〕.Am J Physiol Cell Physiol, 2015；309(12):C835-46.

11 孔春雨.三联疗法治疗老年幽门螺杆菌阳性消化性溃疡患者的最佳时效〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(15)：4265-6.

12 刘建强，王 雯，王 蓉，等.四联疗法根除幽门螺杆菌对胃黏膜剥离术后溃疡愈合的作用〔J〕.中华消化内镜杂志，2015；32(11)：747-50.

13 程胜平，周世龙.复方嗜酸乳杆菌片联合四联疗法治疗幽门螺杆菌阳性溃疡患者的疗效与安全性〔J〕.中国药师，2014；17(6)：993-5.

〔2015-07-19修回〕

(编辑 苑云杰)

The regulation of H.pylori infection on the expression of bicarbonate transporter proteins in duodenal mucosa epithelial cells

DENG Shi-Li, JIN Hai, WEN Guo-Rong,etal.

Department of Digestion, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, Guizhou, China

Objective To investigate the influence of bicarbonate transporter proteins expression on duodenal mucosa epithelial cells of the H.pylori (HP) infected mice.Methods C57 mice were randomly divided into four groups. Three groups were given HP strain-SS1, NCTC11637 and NCTC11639 to be infected, and the control group was given the same dose of PBS gavage. The organs were collected after 2 weeks. In vitro, duodenal epithelial cells were cultured and given HP strain to be infected, and the control group was given the same dose of PBS. Then, cells were collected. The expression of bicarbonate transporter proteins of organs and cells were detected by RT-PCR and Western blot.Results In animal experiment, after the infection, a large number of purple blue bodies were found, which were funny and short by Giemsa staining. After HP strain-NCTC11637 infection on duodenal epithelial cells, the amplification of HP 16srRNA was both simple and well by RT-PCR in mice and cells.After 2 weeks of HP strain-SS1, NCTC11637 and NCTC11639 infection on mice, the mRNA and protein expressions of bicarbonate transporter proteins were significantly lower than those of control group in mice and cells.Conclusions In vivo and in vitro, HP can intervene disease progression by regulating the expression of bicarbonate transporter proteins.

H.pylori；Duodenal ulcer；Bicarbonate transporter proteins；Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)；Anion exchanger pendrin(SLC)26A3；SLC26A6

国家自然科学基金资助项目(No.81160054)

庹必光(1963-)，男，博士，硕士生导师，主任医师，主要从事胃肠上皮细胞离子转运研究。

邓时莉(1982-)，女，硕士，主治医师，主要从事胃肠道离子通道的研究。

R656.6+2

A

1005-9202(2017)09-2086-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.003