水体铬暴露对南方鲇生长、代谢和铬累积分布的影响
2017-05-24邱汉勋李万军闫玉莲谢小军
刘 立,邱汉勋,李万军,闫玉莲,谢小军
(西南大学水生生物及水环境研究所,淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室,重庆北碚 400715)
水体铬暴露对南方鲇生长、代谢和铬累积分布的影响
刘 立,邱汉勋,李万军,闫玉莲,谢小军
(西南大学水生生物及水环境研究所,淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室,重庆北碚 400715)
以南方鲇(SilurusmeridionalisChen)幼鱼(19.75 ± 0.12 g)为研究对象,以K2Cr2O7作为毒物源,在(27.5 ± 0.5)℃条件下分别进行了急性暴露和慢性暴露的毒理效应实验。通过急性暴露实验,测得该种鱼的96 h半致死浓度值(96 hLC50)为56.24 mg/L。在水体Cr浓度分别为0(对照组)、0.937 mg/L(96 hLC50的1/60)和1.875 mg/L(96 hLC50的1/30)条件下,进行了为期8周的慢性暴露实验。结果表明,实验鱼体的特定体重生长率、肥满度和肝脏指数随着Cr浓度的升高而显著降低,肾脏指数随Cr浓度的升高而显著升高;两个Cr浓度组鱼体的蛋白质和能量密度均显著低于对照组,(1/30)96 hLC50浓度组鱼体的脂肪含量显著低于对照组,而前者的水分含量则显著高于后者。两个Cr浓度组鱼体的静止代谢率均显著高于对照组。经过8周水体Cr暴露处理后,实验鱼体的各器官组织中Cr的累积含量均显著高于对照组,其累积含量的顺序均为肾>鳃>肝>肠>全鱼>脑>肌肉;(1/60)96 hLC50和(1/30)96 hLC50浓度组的肾脏的Cr累积含量显著高于其他组织,肌肉的Cr累积含量均显著低于其他组织;鳃组织中Cr含量相对于对照组的增加幅度大大高于其他组织的增幅。
半致死浓度;Cr暴露;生长率;能量代谢;重金属累积
重金属是水生生物环境中重要的污染物,主要通过工业、采矿业、现代农业、生活垃圾和交通运输等人类活动产生。Cr作为常见的重金属污染物之一,也是生物必需的微量元素。人类产生的Cr进入到水生环境后,主要通过水体和食物途径累积到生物体内[1-2],对各种水生生物的生殖发育、氧化胁迫、组织损伤、基因突变等产生毒害作用[3]。鱼类作为人类重要的营养物质来源,被污染而富集在鱼体组织中的Cr会通过食物链最终转移至人类,对人类的健康产生潜在威胁[4]。
长江是我国最大的河流,是我国重要的渔业资源供给水域之一。近些年,长江及其支流受污染物的影响情况已经引起越来越多研究者的关注[5]。本实验室前期调查了长江上游江段的鱼体5种重金属的含量情况,发现长江上游不同江段的常见鱼类均受到了Cr、Pb、Cd、As和Hg不同程度的污染[6-7]。Cr是污染长江上游的主要重金属之一,探讨其污染对鱼类的生态毒理学影响的研究具有重要的理论和实践意义。
本研究选取六价态的Cr作为水体暴露毒物。以南方鲇(Silurusmeridionalis)作为实验对象,观测急性中毒的半致死浓度,以及不同浓度的水体Cr暴露对实验鱼的生长、生化组分、静止代谢和Cr的组织累积与分布等指标的影响,为探讨水体六价Cr暴露对南方鲇生态毒理学机制提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 实验鱼的来源及驯化
本研究采用由西南大学水产科学研究所2016年人工繁殖培育的同批南方鲇幼鱼作为实验对象。选取身体健康、初始体重相近的南方鲇幼鱼用室内循环水养殖系统进行驯化养殖。共采用6套循环水养殖系统,每套系统由10个养殖单元组成。驯化期间每天投喂切碎的草鱼肉块1-2次,达到饱足。
1.2 实验用水
采用纯水制备系统(重庆利迪实验仪器有限公司)获取去离子水,以MgSO4·7H2O,K2SO4,CaCl2·2H2O,NaHCO3配置成总硬度为25 mg CaCO3/L(实际测定为(27 ± 0.5)mg CaCO3/L)的实验鱼养殖用水。暴露处理实验前,以该实验用水养殖驯化2周,水温(27.5 ± 0.5)℃,溶氧大于7 mg/L,pH为7.10 ± 0.2,光周期L∶D=12 h∶12 h。
以重铬酸钾(K2Cr2O7)作为六价Cr离子源(AR,购自重庆川东化工有限公司),用去离子水配成浓度为20 mg/mL(以Cr计)的母液备用,实验前向养殖用水中加入适量母液配置成所需的Cr浓度的实验用水。
1.3 急性暴露实验处理方法
选取体重20 g左右经实验室驯化养殖2周的南方鲇幼鱼随机分组进行实验,暴露实验处理前,在未加入Cr的水中禁食驯化24 h后再进行水体Cr暴露处理。根据预备实验,确定暴露 96 h 后南方鲇的最大全存活和最小全致死 Cr 暴露浓度的大致范围。设置1个对照组和5个Cr处理组,Cr浓度分别为0、25、40 、55、70和85 mg/L。每个处理水平3个重复,每个重复10尾鱼。整个暴露期间不喂食,每24 h换水1/2,换水后取水样,测定水体实际Cr浓度。实验水温保持为(27.5 ± 0.5)℃,水体硬度为(27 ± 0.5)mg CaCO3/L,溶氧量大于7.0 mg/L,光周期为L∶D=12 h∶12 h。暴露实验开始后每隔4 h观察一次,并记录各组鱼的中毒症状和死亡情况。及时将暴露死亡的鱼取出,用去离子水冲洗、沥干,称重后保存于-20 ℃冰箱中。
1.4 慢性暴露实验处理方法
选取20 g左右经实验室驯化养殖2周的南方鲇幼鱼作为慢性暴露处理实验对象,实验的水温、水质硬度及光周期等环境条件与急性实验一致。根据急性实验得到该种鱼的96 hLC50Cr的值为56.24 mg/L,在慢性暴露实验中分别采用96 hLC50的1/30和1/60浓度进行处理,另设1个对照组,共3个处理组,即暴露浓度分别为0、0.937((1/60)96 hLC50)和1.875 mg Cr/L ((1/30)96 hLC50) 。每个浓度组10个水箱,每个水箱6尾鱼,即每个处理梯度共60尾鱼。总暴露时间为8周,实验期间每2 d换60% 的实验用水,每次换水1 h后取水样测定水中的实际Cr浓度。每天投喂1次,并在投喂后1 h捞取食物残渣和粪便。在慢性暴露期间记录鱼的生长及存活状况,将死亡鱼体及时捞出,用去离子水冲洗干净后测定体重、体长,于-20 ℃冰箱保存。
暴露实验结束后,测定鱼体常规生物学参数、静止代谢率、生化组分和组织器官及鱼粉的Cr含量。每个处理组随机选取8尾鱼,采用本实验室设计的鱼类流水式呼吸仪及相应的方法测定南方鲇的静止代谢率[8];选取测定静止代谢后的8尾鱼测定鱼体的生化组成及估算能量密度[9-10];按照GB/T 5009.123-2003的方法[11],测定南方鲇肝、鳃、肾、肠、脑、肌肉组织和全鱼中Cr的含量[7]。
1.5 数据统计分析方式
采用SPSS23.0软件对相关数据进行整理和处理,统计数据以平均值±标准误表示。采用独立样本t检验或单因素方差分析(one-way ANOVA)的最小显著差异法(LSD)检验相关系数间是否具有显著性差异,方差不齐的数据采用非参数检验;运用双因素方差分析(two-way ANOVA)检验水体Cr浓度和组织对组织器官Cr含量的影响。以P<0.05作为数据均值差异显著性的标准。
2 结果
2.1 水体Cr急性暴露实验结果
以水体中Cr的浓度为自变量,相应浓度中南方鲇的死亡率为因变量,得到回归方程:y=1.523 2x- 35.491 (n= 15,R2=0.972 8),其中y为鱼体死亡率,x为水体Cr浓度。采用直线内插法,求得Cr对南方鲇的96 h半致死浓度(96 hLC50)为56.24 mg/L(图1)。
图1 南方鲇水体Cr暴露96 h 死亡率Fig.1 Mortality rate of S.meridionalis in the waterborne Cr exposure for 96 h
2.2 水体Cr慢性暴露对南方鲇生长状态的影响
在实验期间对照组没有鱼死亡,(1/60)96 hLC50浓度处理组出现了11.67%的死亡率(7尾),(1/30)96 hLC50浓度处理组出现了36.67%的死亡率(22尾)(表1)。水体Cr暴露对照组鱼体的肥满度、特定体重生长率、肝指数和肾指数分别为0.84%、1.22%/d、1.67%和0.52%;0.937 mg/L处理组鱼体的肥满度、特定体重生长率、肝指数和肾指数分别为0.75%、0.61%/d、1.17%和0.68%;1.875 mg/L处理组鱼体的肥满度、特定体重生长率、肝指数和肾指数分别为0.74%、0.20%/d、1.13%和0.73%(表1)。统计检验表明,暴露组的终末体重、终末体长及特定体重生长率均显著低于对照组,其中高浓度组也显著低于低浓度暴露组。暴露组鱼体的肥满度均低于对照组,但两暴露处理组间差异不显著(P<0.05)。暴露组的肝脏指数均显著低于对照组,并随暴露浓度的升高具有减小的趋势;暴露组的肾脏指数均显著高于对照组,并随暴露浓度的升高而具有增大的趋势(表1)。
2.3 水体Cr暴露对南方鲇鱼体组分的影响
表2结果表明,水体Cr暴露8周后,水体Cr暴露对照组鱼体水分、蛋白质、脂肪、灰分和能量密度分别为81.30%、12.63%、4.06%、2.01%和4.47 kJ/g;0.937 mg/L处理组鱼体的水分、蛋白质、脂肪、灰分和能量密度分别为82.20%、11.18%、3.67%、2.18%和4.09 kJ/g;1.875 mg/L处理组鱼体的水分、蛋白质、脂肪、灰分和能量密度分别为83.92%、11.52%、3.20%、2.38%和3.98 kJ/g。随着水体Cr离子浓度的升高,实验鱼体的含水量表现升高的趋势,鱼体粗脂肪、粗蛋白质含量和能量密度随着水体Cr浓度的升高而降低,实验鱼体处理组灰分含量随着暴露浓度的升高而升高。1.875 mg/L处理组实验鱼体水分含量显著高于对照组,粗脂肪含量显著低于对照组,而两个Cr暴露处理组的蛋白质含量和能量密度均显著低于对照组。
2.4 水体Cr暴露对南方鲇静止代谢的影响
表2的结果表明,水体Cr暴露对照组、0.937 mg/L和1.875 mg/L处理组实验鱼的特定体重代谢率分别为100.38 ± 4.18、133.05 ± 3.43和126.50 ± 3.60 mg O2/(h·kg)。水体Cr暴露0.937 mg/L和1.875 mg/L处理组实验鱼的特定体重代谢率均显著高于对照组,两个水体Cr暴露处理组之间没有显著性差异。
2.5 水体Cr暴露对南方鲇体内Cr累积与分布的影响
表3的结果表明,在对照组鱼体的鳃、肝、肾、肠、脑、肌肉组织和全鱼中的Cr的含量分别为0.018、0.066、0.094、0.036、0.032、0.007和0.012 mg/kg湿重;0.937 mg/L处理组鱼体的鳃、肝、肾、肠、脑、肌肉组织和全鱼中的Cr的含量分别为10.252、4.245、11.435、1.065、0.167、0.120和0.581 mg/kg湿重;1.875 mg/L处理组鱼体的鳃、肝、肾、肠、脑、肌肉组织和全鱼中的Cr的含量分别为12.262、9.580、14.749、2.097、0.272、0.201和0.865 mg/kg湿重。
表1 水体Cr暴露对南方鲇生长状态的影响Tab.1 Effect of waterborne Cr exposure on growth state of S.meridionalis
注:数据用平均值±标准误表示(mean ± SE,n=8). 特定体重生长率的计算为南方鲇死亡时的体重和死亡时的生长天数,初始体重采用各处理组初始时60尾鱼的平均值;肝脏指数和肾脏指数样本量为30;a, b, c:同行中不同上标字母表示不同暴露浓度间差异显著(P<0.05).特定体重生长率(SGRW)=100%×(lnWt-lnW0)/t,肝指数(HIS)=100%×H/Wt,肾指数(KIS)=100%×K/Wt,肥满度(CF)=100%×Wt/L3,其中W0、Wt、H、K、L和t分别表示初始体重(g)、终末体重(g)、肝脏重(g)、肾脏重(g)、体长(cm)和暴露时间(d).
表2 水体Cr暴露对南方鲇鱼体组分及静止代谢的影响Tab.2 Effect of waterborne Cr exposure on the body composition and resting metabolic rate (RMR) of S.meridionalis
注:数据用平均值±标准误表示(mean ± SE,n= 8);a, b, c:同行中不同上标字母表示不同暴露浓度间差异显著(P<0.05).
对照组鱼体各组织器官中Cr的含量顺序为肾>肝>肠>脑>鳃>全鱼>肌肉;两个浓度水体Cr处理组鱼体组织累积的顺序均为肾>鳃>肝>肠>全鱼>脑>肌肉。双因素方差分析表明,不同组织器官对其Cr含量具有显著影响。在暴露组中,肾显著高于其它组织,鳃显著高于肝、肠、全鱼、脑和肌肉,肝显著高于肠、全鱼、脑和肌肉;各处理条件下肌肉组织均低于其他组织(表3)。
实验鱼的鳃、肝、肾、肠、脑、肌肉和全鱼中Cr的含量随Cr暴露浓度的升高而升高,表现出浓度效应(表3),且3个实验处理组的对应值之间的差异均达到了显著性标准。
表3 水体Cr暴露对南方鲇组织金属累积的影响Tab.3 Cr contents in different tissues of S.meridionalis after waterborne Cr exposure mg/kg 湿重
注:数据用平均值±标准误表示(mean±SE,n=8);a,b,c,d,e:同列中不同上标字母表示不同组织间差异显著(P<0.05);x,y,z:同行中不同上标字母表示不同暴露浓度间差异显著(P<0.05).
3 讨论
3.1 水体Cr暴露对南方鲇生长状态和肝脏、肾脏指数的影响
鱼类的生长状态可以作为环境重金属暴露对鱼类影响的综合生物学指标[12]。在本实验中,经过水体Cr暴露后,南方鲇的特定体重生长率随着Cr浓度的升高均出现了明显的降低趋势。在生长速率受到抑制的同时,南方鲇的肥满度在两个暴露组中也出现了显著降低(表1)。有研究发现水体Cr暴露可以影响虹鳟(Oncorhynchusmykiss)的食欲,并降低摄食效率[13]。经过重金属暴露后,尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)生长速率下降,肥满度降低[14]。有研究者提出,重金属暴露后鱼体需要动用部分能量进行解毒作用,减少在生长上的能量分配[15]。由此造成生长抑制、肥满度降低。
本研究中,肝脏指数在经过8周Cr暴露后出现了降低趋势(表1)。有研究者对污染河流中鱼体肝脏金属累积和肝脏形态大小的关系做了研究,发现肝脏中重金属累积与肝脏指数呈负相关[16]。虹鳟在经过Cd暴露后,肝脏指数减小[17]。有研究认为,重金属暴露后,肝脏体积的变小是因为肝糖原和肝脂肪的消耗在肝脏形态学上的应答反应[18],重金属暴露后造成的脂质过氧化可导致细胞膜的损伤,并使肝细胞死亡[19]。因此,有研究者提出,暴露在金属毒物下的鱼体肝脏指数可以作为毒物影响指标[20]。
本研究中,暴露组实验鱼肾脏出现显著的增大现象(表1)。有研究表明肾脏是重金属的首要靶器官,具有吸收和累积重金属的能力[21]。当重金属与金属硫蛋白结合后会释放进入血液,通过血液循环系统在肾脏的上皮细胞进行吸收,并累积到肾脏中[22]。还有研究发现,在经过Cr毒性暴露后,肾脏出现肾小管上皮细胞加速生长、管腔减少等现象[23]。Cr暴露后的上述效应均可以引起肾脏增大的现象发生。
3.2 水体Cr暴露对南方鲇生化组成和能量代谢的影响
鱼体是由蛋白质、脂肪、碳水化合物和水分等生化物质组成,其中蛋白质和脂肪是其能量的主要载体物质,而碳水化合物含能量一般不超过鱼体总含能量的1%[24-25]。鱼体的生化组成是反映鱼类的营养水平和生理状态的重要指标[24,26]。
已有研究者发现,在水体Cr暴露后脂肪和蛋白质的含量均出现不同程度减少[26]。在本研究中,0.937 mg/L和1.875 mg/L的Cr处理组实验鱼体的脂肪含量相对于对照组分别降低了9.61%和21.18%,蛋白质含量分别降低了11.48%和8.79%,这表明水体Cr的毒性暴露导致鱼体的脂肪和蛋白质含量降低。由此导致受毒物暴露的实验鱼体的能量密度显著下降(表2)。另一方面,由特定体重代谢率可以看出,在经过水体Cr暴露后,受Cr暴露处理组鱼体的代谢水平显著提高(表2),即增加了其基础耗能。有研究者提出,鱼体在暴露于含有重金属的水体后其代谢率升高,以满足机体解毒和抗氧化等生理过程所需的额外能量支出[15]。联系本研究关于水体Cr暴露影响实验鱼生长状态的结果,我们认为南方鲇在水体Cr暴露时,通过提高自身的代谢水平,以应对Cr在体内的解毒作用以及自身损伤的修复,因此,消耗大量额外能量,使鱼体用于贮备累积的能量分配比例降低,导致其生长速率相应降低。
3.3 Cr在南方鲇鱼体内的累积具有组织特异性
鱼体内的重金属离子累积速度比排出速度要快得多,造成重金属在鱼体内不断被蓄积,长期残留在体内[27]。重金属在鱼体内的累积与分布存在组织特异性。而这种在鱼体组织器官中的特异性累积可能与鱼类的性别、鱼龄和鱼种等相关[28]。
在本研究中,0.937 mg/L处理组,鳃、肾、肝、全鱼、肠、肌肉和脑组织和全鱼中Cr的累积分别是对照组的581、122、63、49、29、16和5倍,而在1.875 mg/L处理组中,鳃、肾、肝、全鱼、肠、肌肉和脑组织和全鱼中Cr的累积分别是对照组的695、157、144、74、57、27和8倍。经过Cr暴露后鳃组织中Cr含量在低浓度和高浓度组分别与对照组相比增加了581和659倍,大于其他组织的含量增长幅度,这应当与鳃是鱼体的呼吸和渗透调节器官,直接与水环境接触有关。当鱼类通过水体重金属暴露时,鳃组织是金属水体暴露进入鱼体内的主要吸收和最初累积位点[29]。有研究发现,鳃是由许多细小的鳃小片组成,其鳃总面积约占鱼体总表面积的50%左右。在鳃的外表面上具有与金属阳离子结合的结构位点,可以与游离在水体中的阳离子通过离子键结合俘获金属离子,使得金属离子在鳃组织中大量累积[30]。因此我们认为水体Cr处理组的鳃组织中Cr含量相对于对照组的鳃中含量的增长倍数最高,主要是由于其结构和功能的上述特殊性决定的。
当重金属以不同的途径进入鱼体时,会诱导各组织器官产生大量富含半胱氨酸的金属硫蛋白,结合进入鱼体内的重金属。以减少非生命必需的重金属离子向其他组织的运输来降低毒害作用,起到调节鱼体内自由金属离子浓度的作用[31]。在本研究中,经过8周的Cr暴露后,Cr在南方鲇的肾和肝的累积显著高于除鳃组织以外的其它组织器官,有研究认为由于肝脏的解毒和肾的排泄功能,鱼体的肝脏和肾脏便成为重金属累积的主要部位[3,21]。
另一方面,相比于其它组织,肌肉组织中Cr的浓度在本研究中远低于肾、鳃和肝。有研究提出肌肉组织是金属累积的非活跃组织[32]。肌肉是鱼体组织的占比最大的部分,因此全鱼的Cr累积量高于肌肉却明显低于其他组织。
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(责任编辑:张红林)
Effects of the waterborne hexavalent chromium (Cr) on growth, metabolism and metal accumulation inSilurusmeridionalis
LIU Li, QIU Han-xun, LI Wan-jun, YAN Yu-lian, XIE Xiao-jun
(KeyLaboratoryofFreshwaterFishReproductionandDevelopment,MinistryofEducation;InstituteofHydrobiologyandWaterEnvironment,SouthwestUniversity,Beibei400715,Chongqing,China)
Laboratory tests were conducted on juvenile ofSilurusmeridionalisChen (19.75 g±0.12 g) during acute and chronic exposures to potassium dichromate (K2Cr2O7) at constant water temperature (27.5 ℃±0.5 ℃). The median lethal concentration in 96 hours (96 hLC50) of Cr to the southern catfish was 56.24 mg/L in the acute exposure experiment. In the chronic exposure experiment, fish was exposed to Cr at a series of concentrations of 0 (control group), 0.937 and 1.875 mg/L, which were equivalent to approximately 0, 1/60 and 1/30 of 96 hLC50, respectively for 8 weeks. The chronic experiment results indicated that the mortality of the fish increased with increasing waterborne chromium concentrations. The specific weight growth rate, condition factor and hepatosomatic index all decreased with the increasing Cr exposed concentration. Meanwhile, the kidney index increased with the increasing Cr concentration. The content of crude protein and energy density of the fish exposed to Cr was significantly lower than that in the control group. The content of fat in 1.875 mg Cr/L group was significantly lower than the control, and the water content in the control was significantly lower than the other groups. The resting metabolic rate in two Cr exposure groups were significantly higher than that in the control. The contents of chromium in organs after 8-week exposure could be ordered from higher to lower as following: kidney > gill > liver > intestines > whole fish > brain > muscle. The Cr content in kidney in both exposure groups were significantly higher than that in the other tissues, while the Cr content in muscle in both Cr exposure groups was significantly lower than that in the other tissues. The Cr content in the gill tissue compared with the control group was higher than that in other tissues.
median lethal concentration; Cr exposure;growth rate;energy metabolism; heavy metal accumulation
2016-11-21;
2017-03-16
国家自然科学基金资助项目(31300338);重庆市自然科学基金重点项目(cstc2013jjB80008);中央高校基本科研业务费专项基金(XDJK2016C156)
刘 立(1991- ),男,硕士研究生,专业方向鱼类生理生态学。E-mail: yinhejiankev@qq.com
谢小军。E-mail:xjxie@swu.edu.cn
X503.225
A
1000-6907-(2017)03-0090-07