圆口铜鱼精浆的理化性质分析

王昌霖，吴兴兵，朱永久，杨德国，王亚龙,3，陈 亮,3，杨少荣，王小明

(1. 中国水产科学研究院长江水产研究所，农业部淡水生物多样性保护重点实验室，武汉 430223；2.华中农业大学水产学院，武汉430070；3. 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；4. 中国长江三峡集团公司，成都 610041)

圆口铜鱼精浆的理化性质分析

王昌霖1,2，吴兴兵1，朱永久1，杨德国1，王亚龙1,3，陈 亮1,3，杨少荣4，王小明4

(1. 中国水产科学研究院长江水产研究所，农业部淡水生物多样性保护重点实验室，武汉 430223；2.华中农业大学水产学院，武汉430070；3. 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；4. 中国长江三峡集团公司，成都 610041)

对圆口铜鱼(Coreiusguichenoti)精浆离子和氨基酸成分及精液生理特性进行了检测分析。结果显示，圆口铜鱼精液pH值为7.3，呈弱碱性；精液浓度为39.7%，精子密度为5.3×109个/mL；精浆离子以Na+含量88.7 mmol/L最高，其次是K+，之后为Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+；精浆水解氨基酸总量为2 872.69 μmol/100mL，其中以脯氨酸含量最高，蛋氨酸、酪氨酸和组氨酸含量最低。该结果填补了圆口铜鱼繁殖生物学的相关数据，为圆口铜鱼规模化人工繁育提供了基础资料。

圆口铜鱼(Coreiusguichenoti)；精液浓度；精子密度；精浆离子；水解氨基酸

圆口铜鱼(Coreiusguichenoti)隶属鲤形目(Cypriniformes)、鮈亚科(Gobioninae)、铜鱼属(Coreius)，是长江上游特有的优质经济鱼类。地方俗称方头水密子、水密子、金鳅、圆口、麻花等，广泛分布于金沙江下游、长江上游干流、嘉陵江中下游、沱江下游、乌江下游等水域[1-2]。近年来，随着长江、金沙江及雅砻江水电开发的逐步实施，长江上游圆口铜鱼栖息地萎缩[3]，再加上过度捕捞、环境污染等影响，圆口铜鱼资源量急剧下降[4-5]，对种群的生存构成了威胁，其保护问题迫在眉睫[6]。

目前，在圆口铜鱼繁殖生物学中已有关于早期发育、人工繁殖等方面的研究[7-9]，但是对其精子生物学特性的研究尚未见报道。对鱼类精子生物学特性进行研究，有助于开展鱼类精子的冷冻保存，人工授精稀释液的开发，促进人工繁殖技术的发展，对于物种的保护具有重要意义[10-12]。本研究通过对圆口铜鱼的精子密度、精液浓度和精液pH值等生理特性及精浆离子和氨基酸成分的检测分析，旨在积累圆口铜鱼繁殖生物学的相关数据，为圆口铜鱼规模化人工繁育和物种保护提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 圆口铜鱼来源

试验所用圆口铜鱼来自中国水产科学研究院长江水产研究所的封闭循环水养殖系统(湖北武汉)中人工培育的亲鱼。试验鱼选取体格健壮、外表无损伤及病害、轻压腹部精液自动流出的成熟雄鱼。试验用鱼共15尾，吸取精液前未注射催产剂。

1.2 试验方法

1.2.1 精液的采集与保存

取精液前先以曝气自来水洗净生殖孔，使用干毛巾吸干生殖孔周围及体表水分，之后使用干燥洁净的卫生纸擦拭生殖孔周围，确保吸取精液过程中精子不会遇水激活。采集精液时，轻挤鱼腹两侧使精液流出，采用2 mL注射器缓慢吸取，采集完毕将精液移放入1.5 mL干燥的离心管中，置于4℃冰箱保存待检。要求实验精液无尿、无血、无外来水渗入，遇水迅速散开。

1.2.2 精子密度、精液浓度和pH值的测定

精子密度测定时，用0.85%NaCl溶液将精液稀释3 000倍，使用XB-K-25血细胞计数板在OLYMPUS CX41显微镜下观察、计数。精子密度计算：精子密度(个/mL)=(80小格内精子数/80)×400×104×稀释倍数，检测3尾鱼，每尾重复3次，结果取平均值。精液pH值采用精密pH试纸测定，共检测3尾鱼，每尾重复测定3次，结果取平均值。精液浓度测定时，将精液装入刻度离心管中，常温下3 000 r/min离心30 min[13]，计算精子总体积占精液总体积的百分率，即精液浓度，共检测3尾鱼。

1.2.3 精浆成分测定

采集10尾圆口铜鱼精液，混合后用Neofuge 13R离心机以3 000 r/min速度离心30 min，取上清液放入经硝酸浸泡后干燥的玻璃瓶中，样品测定前于-40 ℃下保存。使用电感耦合等离子质谱仪(ICP)对样品进行离子成分分析，氨基酸自动分析仪根据国标GB/T 5009.124-2003对样品进行水解氨基酸成分分析。

2 结果

2.1 圆口铜鱼精液生理特性

性成熟的圆口铜鱼精液呈乳白色、较粘稠，pH值为7.3，呈弱碱性；精液浓度为39.7%，精子密度为5.3×109个/mL(表1)。

表1 圆口铜鱼精液生理特性Tab.1 The basic characteristics of C.guichenoti milt

2.2 精浆主要离子成分

圆口铜鱼精浆中以Na+和K+为主要离子成分，Na+含量最高，为88.7 mmol/L；其次是K+，为10.51 mmol/L；之后Ca2+含量较低为1.689 mmol/L；Mg2+为0.792 mmol/L；Zn2+为0.02 mmol/L；Cu2+含量最低，为0.002 3 mmol/L(表2)。

表2 圆口铜鱼精浆中主要离子成分Tab.2 Composition of main ions in C.guichenoti semen (mmol/L)

2.3 水解氨基酸成分

圆口铜鱼精浆中水解氨基酸总量达2 872.69 μmol/100 mL，其中以脯氨酸含量最高，为1 649.18 μmol/100 mL；其次是赖氨酸，为205.35 μmol/100 mL；蛋氨酸含量最低，为8.99 μmol/100 mL(表3)。

表3 圆口铜鱼精浆中水解氨基酸成分Tab.3 Composition of hydrolyzed amino acidsC.guichenoti semen (μmol/100mL)

3 讨论

3.1 精液生理特性

精子密度和精液浓度是鱼类精子主要的生理特性，鱼类精子密度和精液浓度在不同种类之间，同种的不同个体之间以及同一个体在繁殖季节的不同阶段都是不同的。圆口铜鱼精子的平均密度为5.3×109个/mL，低于其它淡水鱼类，如高白鲑(Coregonuspeled)精子平均密度为28.7×109个/mL[14]，大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)精子平均密度为14.5×109个/mL[15]，鲤(Cyprinus carpio)精子平均密度为29.4×109个/mL，团头鲂(Megalobramaamblycephala)精子平均密度为33.2×109个/mL，四大家鱼精子密度为26.6×109个/mL～35.6×109个/mL[13]，圆口铜鱼与鲟鱼精子密度相比差别不大，如达氏鲟(Acipenserdabryanus)精子平均密度为1.52×109个/mL[12]，中华鲟(A.sinensisGray)精子的平均密度为3.26×109个/mL[11]，史氏鲟(Acipenserschrenki)精子密度为2.45×109个/mL～9.5×109个/mL[16]。研究精子密度可为人工繁殖提供技术参数，已有研究表明，淡水鲤科鱼类精卵配比达3.5×105尾·卵时，可获得85%以上的受精率[13-14]。参照此标准，圆口铜鱼繁殖力为1.3～4万粒[7]，在进行人工授精时，所需精子尾数为(4.55～14)×109尾，根据表1中圆口铜鱼成熟雄鱼平均精液量为0.75 mL，平均精子密度为5.3×109个/mL，笔者建议在进行圆口铜鱼人工授精时，可将雌雄比例控制在1∶2～1∶3较为合适。

圆口铜鱼的平均精液浓度为39.67%，低于四大家鱼精液浓度58.3%～69.1%[13]，高于鲟鱼精液浓度，如中华鲟平均精液浓度为17.37%[11]，达氏鲟平均精液浓度7.67%[12]。多数鱼类是卵生种类，体外受精，这样需要相对较大量的精液才能保证每个卵子都有受精的机会，所以鱼类精液的浓度相对较大[17]。圆口铜鱼精液pH值范围为7.3，呈弱碱性，和其他鱼类相似，是对自然水体环境适应的结果。

3.2 圆口铜鱼精浆主要离子成分

在圆口铜鱼精浆中，Na+和K+是主要的离子成分，起着调节精浆渗透压的重要作用，且在动物组织中，K+主要集中于细胞内，Na+主要分布于细胞外，存在于细胞间液、淋巴和血液中，细胞外K+的含量应该低于Na+[18]，这与本实验的结果是一致的。圆口铜鱼精浆中Ca2+和Zn2+的含量明显高于其他鱼类，有研究表明Ca2+是多数鱼类精子激活所必需的[19]，较低浓度的Ca2+就能引起精子的聚集，且随浓度的升高，聚集现象会更明显，同时会表现对精子强烈的活力抑制作用[20-23]，因此，圆口铜鱼精浆中较高的Ca2+有利于抑制精子在精浆中的运动。精浆中Zn2+的含量与精液品质优劣有密切关系，含量过低，精液品质差，精浆中Zn2+含量高，则精液质量好[12]，圆口铜鱼精浆中Zn2+含量较高，代表其精液质量较好。另外圆口铜鱼中Mg2+的含量也较其他几种鱼类高出许多，由此表明种属间精浆离子成分存在较大的差异，但造成这种差异的原因尚不十分清楚，有待于进一步的研究。

3.3 水解氨基酸成分

圆口铜鱼精浆的水解氨基酸总量为2 872.69 μmol/100mL，其中以脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸等6种氨基酸含量相对较高(尤其以脯氨酸的相对浓度最高)，蛋氨酸、酪氨酸和组氨酸相对含量最低。结果与鲁大椿等[24]对我国草、鲤、鲢和鳙等鱼类精浆水解氨基酸含量的测定结果有相似之处，均是以赖氨酸、谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸的浓度较高，脯氨酸、精氨酸浓度有较大差异，表明鱼类精浆氨基酸浓度存在一定种间差异。氨基酸可能形成一种能量基质，为精子泳动提供能源[25]。本研究结果显示圆口铜鱼精液中的氨基酸浓度很高，表明在繁殖季节中圆口铜鱼成熟精子的代谢活动旺盛。

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(责任编辑：张红林)

Analysis of physical and chemical properties of seminal plasma ofCoreiusguichenoti

WANG Chang-lin1,2，WU Xing-bing1，ZHU Yong-jiu1，YANG De-guo1，WANG Ya-long1,3，CHEN Liang1,3， YANG Shao-rong4，WANG Xiao-ming4

(1.KeyLaboratoryofFreshwaterBiodiversityConservation,MinistryofAgricultureofChina,YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences，Wuhan430223,China;2.CollegeofAquaculture,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China;3.CollegeofFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China;4.ChinaThreeGorgesCorporation,Chengdu610041,China)

This paper focused on the main physiological characteristics of semen, seminal plasma ion and amino acid composition ofCoreiusguichenoti. The results showed that the semen pH and semen concentration ofC.guichenotiwere at the range of 7.3 and 39.7%, respectively, and which was weakly alkaline. The sperm density was 5.3×109ind./ mL. The highest content in plasma was Na+with the concentration of 88.7 mmol/ L, then followed by K+,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Cu2+. The total amount of hydrolyzed amino acids in seminal plasma was 2 872.69 μmol/ 100 mL, and the content of proline was the highest, and that of methionine, tyrosine and histidine were the lowest. The results could enrich the research contents of fish sperm biology and provide basic theory support for large-scale artificial breeding and species protection.

Coreiusguichenoti; semen concentration; sperm density; seminal plasmaion; hydrolyzed amino acids

2017-01-11；

2017-03-15

农业部公益性行业科研专项经费项目(201203086-02)；中国长江三峡集团公司科研专项(JGJ0252013)

王昌霖(1992- )，男，硕士研究生，专业方向为鱼类生态学。E-mail：479695090@qq.com

杨德国。E-mail：yangdg@yfi.ac.cn

S917.4

A

1000-6907-(2017)03-0041-04