复方血栓通胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠bFGF的影响

复方血栓通胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠bFGF的影响

李植灿 姚庆阳

目的观察复方血栓通胶囊对脑缺血再灌注损伤后大鼠脑组织碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）表达的影响。方法建立大鼠脑缺血再灌注模型，于梗塞前和再灌注前5 min灌胃给药，于再灌注后3 d行神经功能缺损评分，采用免疫组织化学法检测大鼠缺血区脑组织bFGF表达情况，TTC染色检测脑梗死体积。结果与缺血再灌注组相比，复方血栓通胶囊治疗组大鼠脑组织bFGF的表达升高（P＜0．05）；大鼠神经功能缺损评分及脑梗塞体积减少（P＜0．05）。结论bFGF是脑缺血再灌注损伤的保护性因子，复方血栓通胶囊促进缺血再灌注损伤后脑组织中bFGF的表达而发挥脑保护作用。

复方血栓通胶囊；脑缺血；再灌注损伤；碱性成纤维细胞生长因子

碱性成纤维细胞生长因子是一种重要的神经营养因子，能保护神经细胞、促进神经生长、修复受损神经细胞，对脑缺血损伤的神经功能恢复有很好的改善作用。本研究通过建立脑缺血再灌注大鼠模型，并给予复方血栓通胶囊作为干预药物，探讨复方血栓通胶囊对bFGF的表达的影响及意义。

1 材料和方法

1.1 实验动物、主要实验药物及试剂

健康雄性SD大鼠60只，体质量280～320 g（南京君科生物工程有限公司购买）；复方血栓通胶囊（广东众生药业药业有限公司）；S-P免疫组化染色试剂盒及AEC试剂盒（上海经科化学科技有限公司）；氯化三苯四氮唑（TTC）染色液（美国Amresco公司）；兔抗大鼠bFGF多克隆抗体（北京中杉金桥生物技术公司）。

1.2 实验动物分组及模型制备

60只大鼠随机分为缺血再灌注组（n=24）、复方血栓通治疗组（n=24）及假手术组（n=12）。脑缺血再灌注组和复方血栓通治疗组又分为免疫组化组（n=12）及测体积组（n=12）。复方血栓通胶囊用PBS缓冲液配制成混悬液。复方血栓通治疗组于梗塞前和再灌注前5 min复方血栓通胶囊混悬液（1 g/kg）灌胃给药。缺血再灌注组给予等量PBS缓冲液。复方血栓通治疗组和缺血再灌注组参考改良Longa线栓法[1]制备大鼠大脑中动脉栓塞模型，假手术组大鼠仅暴露颈总动脉但不插入线栓，血流阻断2 h后拔出线栓，形成再灌注。

1.3 神经功能缺损评分

3 d后在大鼠处死前参照Longa[1]法进行神经功能评定：0分：无神经功能缺损症状；1分：轻微神经功能缺损，左侧前肢不能伸展；2分：中度局灶性神经功能缺损，行走时向左侧转圈；3分：重度局灶性神经功能缺损，行走时向左侧倾倒；4分：不能行走，或者意识丧失。其中评分0分和4分均被剔除，同时按要求及时补充大鼠入组，保证每组大鼠只数不变。

1.4 免疫组化法检测bFGF表达

脑缺血再灌注后3 d，将大鼠用10%水合氯醛深度麻醉，断头取脑，置入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，从视交叉吻合端至尾端冠状连续切片，片厚4 μm，切片经常规脱水、浸蜡、包埋后做成石蜡切片，严格按照试剂盒说明书操作，进行bFGF免疫组化染色。bFGF阳性反应物质主要分布在细胞浆，偶见核表达，显色为红褐色。使用显微照相，连续拍照6个高倍视野（×400），分别计数免疫反应阳性的细胞数。

1.5 梗死体积（TTC法）的检测

测体积组断头取脑后，将脑放入-20℃的冰箱速冻10 min，取出大脑后连续冠状面切片6片，片厚2 mm，将脑片放入盛1%TTC溶液中恒温避光孵育30 min。脑梗死灶成白色，而正常脑组织为红色。用数码相机拍照，利用病理图象分析仪计算出每个脑片的梗死面积和脑梗塞侧半球面积，并计算出体积，V=t（A1+A2+…An）-（A1+An）t/2，其中t为切片厚度，A为梗死面积。为了减小实验操作误差，我们以相对梗死体积表示，V%=梗死体积/缺血半球体积×100%。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行分析处理，计量资料以（均数±标准差）表示，采用t检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能缺损评分

假手术组无神经功能缺损症状，复方血栓通胶囊治疗组和缺血再灌注组表现不同程度神经功能缺损症状，两组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 脑梗死体积

缺血再灌注组和复方血栓通胶囊治疗组均可见脑梗死病灶，两组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.3 脑缺血组织bFGF表达情况

假手术组偶见少量bFGF阳性细胞的表达，缺血再灌注组及复方血栓通胶囊治疗组可见大量bFGF阳性表达，细胞浆染成褐色、红褐色。与假手术组比较，缺血再灌注组及复方血栓通胶囊治疗组bFGF阳性细胞显著增加（P＜0.05）。与缺血再灌注组相比，复方血栓通胶囊治疗组bFGF阳性细胞数增加更加显著，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1及图1、2、3。

3 讨论

bFGF是一种活性蛋白多肽物质，是细胞的有丝分裂原，可促进多种细胞的有丝分裂，并可促进新生血管生成、生长和发育[2]。脑缺血再再灌注损伤后机体可启动一个复杂的神经保护网络，bFGF作为一种重要的神经营养因子，可通过与其相应受体结合发挥神经保护作用[3]。Kawamata等[4]在大鼠脑缺血模型中，经侧脑室注入bFGF，发现缺血2 h给药，可以明显缩小脑梗死范围，减少神经元缺失；缺血24 h给药虽不能降低脑梗死范围，却仍能促进神经功能的恢复。本实验在脑缺血再灌注损伤后，bFGF蛋白的表达明显上调，与假手术组有显著性差异，与国内外相关研究基本一致。

表1 神经功能缺损评分、脑梗死体积及bFGF表达的比较 （

表1 神经功能缺损评分、脑梗死体积及bFGF表达的比较 （

注：与假手术组相比较，aP＜0．05；与缺血再灌注组相比较，bP＜0．05

图1 假手术组大鼠皮层bFGF染色（×400）可见少量阳性细胞数

图2 缺血再灌注组大鼠皮层bFGF染色（×400）可见大量阳性细胞数

图3 复方血栓通胶囊治疗组大鼠皮层bFGF染色（×400）大量阳性细胞数

复方血栓通胶囊的主要药用成分为三七总皂苷，并辅以丹参、黄芪、玄参，具有抑制血栓形成、溶栓、扩张血管、保护血管内皮、改善微循环等作用[5]。药理研究证明：复方血栓通胶囊具有增加凝血酶、促进血块溶解、缩短凝血时间、抗血栓、促进纤溶、提高缺氧耐受力、增加血流量、增加血管灌流量等作用，是治疗血管性疾病的良好药物[6]。本实验发现，脑缺血再灌注损伤后予复方血栓通胶囊干预后，大鼠脑梗死体积及神经功能缺损较少，bFGF的表达显著增高，说明bFGF在复方血栓通胶囊治疗脑缺血再灌注损伤表达增高，提示bFGF对缺血脑组织起到保护作用。

[1] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al． Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]． Stroke，1989，20（1）：84-91．

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[3] 闻公灵，娄季宇，白宠英． bFGF对脑缺血再灌注大鼠ICAM-1表达及脑组织含水量的影响[J]． 中国实用神经疾病杂志，2010，13（17）：10-12．

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[5] 王妮娜，曾晓聪． 复方血栓通胶囊与甲钴胺联合治疗糖尿病周围神经病变的疗效观察[J]． 临床合理用药，2012，5（5C）：72-73．

[6] 包兴旺． 复方血栓通胶囊治疗视网膜静脉阻塞51例[J]． 浙江中医杂志，2013，48（1）：75．

The Effect of Compound Xueshuantong Capsule on the Expression of bFGF in Brain of Rats With Focal Cerebral Ischemia Reperfusion

LI Zhican YAO Qingyang Department of Neurology, Quanzhou First Hospital Af fi liated to Fujian Medical University, Quanzhou Fujian 362000, China

ObjectiveTo investigate the effects of compound Xueshuantong capsule on the expression of bFGF in the brain after focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.MethodsThe establishment of rat cerebral ischemia reperfusion model in pre infarction and reperfusion 5 min before intragastric administration, 3 d after reperfusion, the neurological deficit score, immunohistochemical method to detect the expression of brain tissue in ischemic area of rats bFGF, TTC staining to detect the infarct volume.ResultsCompared with the ischemia-reperfusion group, the expression of bFGF was increased signi fi cantly in compound Xueshuantong treatment group (P＜ 0.05). The infarct size and the scores of neurologicalde fi cit in Xueshuantong capsule treatment group were decreased (P＜ 0.05).ConclusionbFGF is a protective factor in cerebral ischemia reperfusion injury. Xueshuantong capsule could protect the brain injury through increasing the expression of bFGF in brain tissue of rats with cerebral ischema reperfuson.

compound Xueshuantong capsule; cerebral ischemia; reperfusion injury; bFGF

R277．7

A

1674-9316（2017）09-0076-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．09．045

福建医科大学附属泉州市第一医院神经内科，福建 泉州362000