人质子感知受体G2A和OGR1在低氧性肺动脉高压患者外周血细胞中的表达*

武 敏， 杨敬平， 徐喜媛， 郭智敏， 卜宝英

(内蒙古医科大学第三附属医院 内蒙古包钢医院， 包头 014010)

人质子感知受体G2A和OGR1在低氧性肺动脉高压患者外周血细胞中的表达*

武 敏， 杨敬平△， 徐喜媛， 郭智敏， 卜宝英

(内蒙古医科大学第三附属医院 内蒙古包钢医院， 包头 014010)

目的：检测人质子感知受体G蛋白偶联受体2A(G2A)和卵巢癌G蛋白偶联受体1(OGR1)在低氧性肺动脉高压(HPH)患者外周血细胞中的变化。方法：研究对象选取31例HPH患者为低氧性肺动脉高压组(HPH组)，男性16例，女性15例，年龄(65.19±5.86)岁。同时符合中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组诊断标准和呼吸衰竭诊断标准，选取30例健康体检者为正常组(NC组)，男15例，女15例，年龄(63.47±6.16)岁。心脏彩超计算HPH组肺动脉压力、进行血气分析和肺功能检测，采集外周血检测G2A、OGR1基因mRNA表达水平、血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。结果：HPH组PaCO2较NC组明显增高(P<0.05), 1 s用力呼气容积占预计值的百分比(FEV1pro%)和1 s用力呼气容积与用力肺活量比值(FEV1/FVC)明显低于NC组(P<0.05)。HPH组外周血中G2A mRNA及TNF-α含量明显高于NC组(P<0.05)。OGR1 mRNA与NC组无差别。HPH组G2A mRNA及TNF-α表达与肺动脉压力呈显著正相关。结论：肺动脉高压患者外周血细胞中质子感知受体G2A表达增加，TNF-α水平增加，G2A的表达和TNF-α水平与肺动脉压力呈明显正相关。

低氧性肺动脉高压；质子感知受体；G2A；OGR1；TNF-α

【DOI】 10.12047/j.cjap.5394.2017.022

低氧性肺动脉高压(hypoxia induced pulmonary hypertension,HPH)是由于低氧引起血管内皮细胞损伤，血管内皮合成和分泌的各种血管舒缩因子平衡失调，导致肺动脉压力和阻力增高，是肺源性心脏病发病过程的中心环节，严重威胁人类健康[1-3]。由慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease COPD)引起的低氧性肺动脉高压致残率、死亡率高，给家庭和社会带来了沉重的负担，迄今为止尚无有效的治疗手段。因此阐明HPH发生机制及寻找有效治疗手段，对防治HPH的发生发展至关重要。

卵巢癌G蛋白偶联受体1(ovarian cancer G protein-coupled receptor 1，OGR1)亚家族是新近发现的一类对质子敏感的G蛋白偶联受体，包括OGR1、T细胞死亡偶联基因8(T-cell death associated gene 8，TDAG8)、GPR4及诱导细胞停滞于G2/M期的G蛋白偶联受体G2A(G2 accumulation)等4种受体，统称为OGR1亚家族受体[4，5]。它们广泛表达于血管内皮和平滑肌细胞中，与肿瘤的发生和转移、细胞骨架重组、免疫系统和血管系统功能等生理和病理过程密切相关，对生物体机能调节有重要意义。该亚家族可通过几种异源三聚体G蛋白包括Gs，Gi，Gq及G12/13诱导多条细胞内信号转导途径，执行着不同功能。目前OGR1亚家族在血管系统的表达研究很少。本研究将通过检测HPH患者质子感知受体G2A、OGR1在外周血细胞中的表达，了解其在HPH中的变化，为进一步寻找早期诊断及治疗低氧性肺动脉高压提供理论依据

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选自2013年11月～2014年11月内蒙古包钢医院呼吸与危重症医学科住院的COPD存在HPH患者31例为低氧性肺动脉高压组(HPH组)，男性16例，女性15例，年龄(65.19±5.86)岁。同时符合下述全部纳入标准：符合中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组诊断标准[6]，超声心动图预测肺动脉收缩压≥40 mmHg，动脉血气分析符合呼吸衰竭诊断标准[7]。排除标准：除外支气管哮喘、支气管扩张症、充血性心力衰竭、肺结核、闭塞性细支气管炎、弥漫性泛细支气管炎、左心疾病所致的肺动脉高压，慢性血栓栓塞性肺动脉高压，结缔组织所致肺动脉高压，合并肝、肾等其它慢性疾病史，合并有严重全身性疾病。同期本院健康体检者30例为正常组(NC组)，男15例，女15例，年龄(63.47±6.16)岁。本研究经过内蒙古包钢医院医学伦理委员会批准，所有研究对象均签署书面知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 观察指标 (1)心脏彩超：固定专人对所有患者于入院第1天进行心脏彩超检查，包括右心功能指标，记录收缩期右房压、三尖瓣返流的最大压差、肺动脉收缩压数值。肺动脉压力应用超声心动图预测，方法为三尖瓣返流法估测肺动脉收缩压(pulmonary artery systolic pressure,PASP)，在无右室流出道梗阻及肺动脉狭窄的情况下，肺动脉收缩压≈右室收缩压，公式为RVSP=△P+SRAP(RVSP=右室收缩压；SRAP=收缩期右房压；△P=三尖瓣返流的最大压差)。轻度三尖瓣返流时SRAP为0.667 kpa(5 mmHg)，中度三尖瓣返流时SRAP为1.333 kpa(10 mmHg)，重度三尖瓣返流时SRAP为2.000 kpa(15 mmHg)。(2)血气分析：入组后即刻抽取动脉血，采用德国罗氏有限公司cobasb123血气分析仪行动脉血气分析检测。(3)肺功能：使用德国耶格公司生产的Jaeger肺功能仪，固定专人对所有患者于入院第1天进行肺功能检测，观察第1秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV1%pro)、用力肺活量占预计值百分比(FVC%pro)、第一秒用力呼气容积占用力肺活量百分比(FEV1/FVC)指标。

1.2.2 外周血Real Time-PCR检测外周血中G2A和OGR1的mRNA表达 (1)所有研究对象均于入组时采集外周静脉抗凝血4 ml，2 ml抗凝血加入血液RNA稳定剂室温放置2 h，-70℃冰箱保存；另2 ml抗凝血于采血后1 000 r/min ×15 mim离心，上清液分装于EP管中，-70℃冰箱冻存。按RNA prep pure 血液总RNA提取试剂盒(天根生化有限科技公司)操作说明进行血液中总RNA的提取，并合成cDNA。根据NCBI gene bank上编号NM_002046.3(GAPDH)，按SYBR Green I 定量PCR引物设计要求，利用Primerblast软件设计质子感知受体及内参基因特异定量PCR引物:TH-G2A-F：5′-TTTGCCATCCCTCTCTCCAT-3′,TH-G2A-R：5′-GCTCTGCTTGATGCTCCTGAA-3′,产物长度236 bp；TH-OGR1-F：5′-TCGCCAAGGGCGTTTTC-3′,TH-OGR1-R：5′-GTCGGCGACGCAGTTGA-3′,产物长度148 bp；GAPDH-F：5′-ATGAACATGGCTGTGCCTTTG-3′GAPDH-R5′-AGCACCCCTAACCTTGTGC-3′，产物长度116 bp。以上引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。(2)PCR反应条件：预变形：95℃ 30 s；变形：95℃ 5 s；退火：60℃ 20 s；延伸：72℃ 30 s，共50个循环。(3)分析Real-Time PCR扩增曲线计算目的基因的表达水平以GAPDH为内参，每组设4个平行孔；各标本目的基因CT值与内参基因GAPDH CT值相减标化目的基因的表达量，用△CT法计算结果；公式为:平均相对含量%=未知样品的相对含量/对照样品的相对含量=2-平均△CT其中，△CT未知样品=CT未知样品-CT内参。

1.2.3 ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子α蛋白含量 按照TNF-α ELISA定量检测试剂盒(北京卡努生物科技有限公司)说明书操作进行。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 HPH组与NC组临床特点的比较

HPH组与NC组相比在年龄、性别方面无显著性差异。HPH组PaCO2较NC组明显增高(P<0.05)。HPH组FEV1pro%、FEV1/ FVC%明显低于NC组(P<0.05,表1)。HPH组PASP为(60.03±15.79)mmHg，NC组健康体检者因为心脏彩超无三尖瓣返流，不能计算出PASP。

2.2 HPH组与NC组外周血G2A、OGR1 mRNA表达量的比较

以GAPDH RNA作为内参，进行G2A和OGR1定量PCR检测。 HPH组患者外周血中G2A的表达显著高于NC组(P<0.01)，HPH组患者外周血中OGR1表达与NC组相比无差异(表2，图1)。

GroupnGender(male/female)Age(years)PaCO2(mmHg)FEV1pro(%)FEV1/FVC(%)NC30 15/1563.47±6.1639.40±3.39109.0±18.382.6±3.6*HPH31 16/1565.19±5.8654.54±20.88*39.6±12.8*55.5±7.7*

HPH: Hypoxia induced pulmonary hypertension; NC: Normal control; PaCO2: Pressure of carbon dioxide; FEV1: Forced expiratory volume in 1 s; FVC: Forced vital capacity

*P<0.05vsNC group

GroupnG2AOGR1NC307.33±5.391.40±0.98HPH3133.36±12.35**1.17±0.94

HPH: Hypoxia induced pulmonary hypertension; NC: Normal control; G2A: G2 accumulation； OGR1: Ovarian cancer G protein-coupled receptor 1

**P<0.01vsNC group

2.3 ELISA法检测血清中TNF-α含量

HPH组TNF-α平均含量(0.26±0.09)ng/L显著高于NC组(0.17±0.07)ng/L(P<0.01)。

2.4 HPH组质子感知受体表达和TNF-α含量与PASP的相关性分析

经Pearson 直线相关分析，HPH组G2A 及外周血TNF-α含量与PASP呈显著正相关(P<0.01，图2),HPH组OGR1与PASP无相关。

3 讨论

COPD是大气中有害颗粒和有害气体引起的肺部慢性炎症进而引起肺部结构重塑的一种疾病，长期缺氧导致肺循环阻力和肺动脉压持续升高，引起肺血管结构发生重构，这一临床症状被称为低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)。研究发现，低氧低压培养的SD大鼠肺动脉病例切片中缺氧组肺动脉壁增厚使管腔严重狭窄,而正常组大鼠肺动脉壁正常[8]。大量研究证明 COPD 患者存在气道的炎症。其炎症反应与COPD并发肺动脉高压的关系日益受到关注。为了适应和对抗低氧，机体会启动炎症和免疫反应。有研究发现，HPH患者及大鼠造模的痰和支气管肺泡灌洗液检测，发现大量促炎症细胞因子如TNF-α,IL-l和IL-6等显著升高，这些因子可进一步增强炎症反应[9]。TNF-α由肺泡巨噬细胞产生的一种细胞因子，为促炎细胞因子。本研究中低氧性肺动脉高压组TNF-α的表达明显高于健康体检组，证实了TNF-α参与慢性缺氧下的肺血管收缩反应、肺动脉高压的形成。

Fig. 2 Correlation of expression level of the proton-sensing receptor, TNF-α and pulmonary artery pressure in HPH group A: G2A and PASP； B: OGR1 and PASP； C: TNF-α and PASP; TNF-α： Tumor necrosis factor-α; HPH: Hypoxia induced pulmonary hypertension; PASP: Pulmonary artery systolic pressure

本研究证实G2A在低氧性肺动脉高压组高表达，且G2A表达与肺动脉压力呈正相关，提示G2A参与了低氧性肺动脉高压的发生发展。低氧性肺动脉高压患者中G2A的表达明显高于正常组，考虑与肺动脉高压患者常伴有呼吸衰竭有关。呼吸衰竭所致缺氧或缺氧伴二氧化碳潴留状态，机体内环境呈酸性环境。在缺氧和炎症情况下，由于细胞微环境缺氧引起无氧糖酵解产生大量乳酸，导致炎症部位形成酸性微环境[10]，酸性微环境可以广泛调节多种细胞类型的促炎和抗炎反应，从而加剧或改善炎症及其相关疾病状态[11,12]。免疫炎症反应是一个复杂的网络，我们可以通过寻找和阻遏G2A参与的一条或多条关键信号通路的激活，达到最佳治疗效果。

检测G2A mRNA的表达可早期发现肺动脉高压患者，对质子感知受体、炎症因子与低氧性肺动脉高压的关系研究可为临床预防和治疗 COPD 合并肺动脉高压提供依据。同时为进一步研究质子感知受体在肺动脉高压发生、发展中的作用提供研究基础,为从分子水平早期干预肺动脉高压进展提供理论基础。

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Expressions of G2A and OGR1 in peripheral blood cells of patients with hypoxia induced pulmonary hypertension

WU Min， YANG Jing-ping△， XU Xi-yuan, GUO Zhi-min, BU Bao-ying

(The Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， BaoGang Hospital, Baotou 014010， China)

Objective: To detect the expression changes of proton-sensing receptor G2 accumulation (G2A) and ovarian cancer G protein-coupled receptor 1(OGR1) in human peripheral blood cells in hypoxic pulmonary hypertension patients(HPH). Methods: Thirty-one patients with HPH were enrolled for HPH group(16 men and 15 women，age: (65.19±5.86) and thirty healthy persons were enrolled for the control group (NC group). The peripheral blood samples were collected and the mRNA expressions of G2A and OGR1 were determined by using real-time fluorescent quantitative PCR. The serum levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) were detected by using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results: PaCO2 was increased significantly in HPH group than that of the NC group (P<0.05). Forced expiratory volume in 1 sencond(FEV1)pro% and FEV1/forced vital capacity(FVC)in HPH group were significant lower than those of the NC group(P<0.05). The expressions of peripheral blood G2A mRNA and TNF-α in HPH group were increased dramatically than those of the NC group(P<0.05). The expressions of OGR1 mRNA in peripheral blood had no difference between HPH group and NC group. The expressions of G2A and TNF-α in HPH group were positively related to pulmonary artery pressure significantly. Conclusion: The expression of proton-sensing receptor G2A and the level of TNF-α are increased in peripheral blood cells of patients with pulmonary hypertension.The expressions of TNF-α,G2A and pulmonary artery pressure have positive correlation in the HPH group.

hypoxia induced pulmonary hypertension(HPH)； the proton-sensing receptor； G2A； OGR1； TNF-α

2015-12-08

2016-06-26

R56

A

1000-6834(2017)01-085-04

△【通讯作者】Tel： 0472-5992706； E-mail: yangron@ sina.com.cn