十全育真汤对H22荷瘤小鼠免疫功能的影响*

朱云超， 詹光杰， 袁德培， 杨付明， 黄 琼

(湖北民族学院医学院， 恩施 445000)

十全育真汤对H22荷瘤小鼠免疫功能的影响*

朱云超△， 詹光杰， 袁德培， 杨付明， 黄 琼

(湖北民族学院医学院， 恩施 445000)

目的：研究十全育真汤对荷瘤小鼠免疫功能的影响，探讨十全育真汤抗肿瘤的作用机制。方法：SPF级雄性昆明种小鼠30只，制成荷H22小鼠肝癌细胞移植瘤模型，随机分为模型组、阳性对照组及十全育真汤组(n=10)；另选择未接种小鼠10只为正常对照组。正常对照组、模型组每天按10 ml/kg灌胃生理盐水及蒸馏水，阳性对照组、十全育真汤组每天按8 g/kg、18 g/kg灌胃参一药液(80 mg/ml)与十全育真汤剂。连续给药14 d后处死小鼠，测量胸腺、脾脏指数及抑瘤率，检测外周血中白细胞、淋巴细胞含量及T细胞亚群CD3、CD4、CD8细胞百分比，血清中白细胞介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及干扰素-β(IFN-β)的含量，淋巴细胞增殖能力及NK细胞杀伤功能。结果：较正常对照组，十全育真汤组小鼠体重明显增加，脾脏指数显著增大(P<0.05)；白细胞、淋巴细胞CD4、CD8、CD3及TNF-α含量明显升高(P<0.05)； IL-2、IFN-β含量显著下降(P<0.05)；淋巴细胞增殖能力、NK细胞杀伤功能明显升高(P<0.05)。与模型组相比，十全育真汤组小鼠胸腺、脾脏指数显著增大(P<0.05)；白细胞、淋巴细胞CD3、 CD4、IL-2、IFN-β及TNF-α含量明显升高(P<0.05)，CD8含量则显著降低(P<0.05)；NK细胞杀伤功能及淋巴细胞增殖能力显著增加(P<0.05)。结论：十全育真汤可促进H22荷瘤小鼠免疫器官的生长，增强机体免疫功能，有利于肿瘤机体的恢复。

十全育真汤；H22荷瘤小鼠；免疫

【DOI】 10.12047/j.cjap.5380.2017.012

十全育真汤出自张锡纯的代表作《医学衷中参西录》治阴虚劳热方篇[1]。由野台参、生黄芪、生山药、知母、玄参、生龙骨、生牡蛎、丹参、三棱及莪术组成，此方曾治疗多种慢性病、虚损病并多获良效。本研究观察十全育真汤对荷瘤小鼠免疫功能的影响，探讨十全育真汤抗肿瘤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级昆明种雄性小鼠，7周，体重(24.6±1.7)g，购自湖北省实验动物研究中心[生产许可证号：SCXK(鄂)2008-0005]。

1.2 实验药品与仪器

小鼠肝癌系H22细胞购自上海博谷生物科技有限公司，参一胶囊购自吉林亚泰股份公司，CCK-8(cell proliferation and cytotoxiciuy Assay kit)购自碧云天生物技术公司，刀豆蛋白A(ConA)与四甲基偶氮哇盐(MTT)购自美国Sigma公司，PE标记抗小鼠CD3、CD8、FITC标记抗小鼠CD4荧光抗体及红细胞裂解液及溶血素购自美国Beckman公司，白细胞介素-2(interleukin 2，IL-2)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)及干扰素-β(interferon-β，IFN-β)检测试剂盒购自南京建成生物制品研究所，其他化学试剂为国产分析纯试剂购自湖北恩施乐之塬科技公司)。精密电子天平(上海天平仪器厂)，全自动酶标仪(美国Thermo公司)，低温冷冻离心机(美国Beckman公司)、流式细胞仪(美国Beckman公司)、MCO-18AIC37℃CO2恒温培养箱(日本三洋机电株式会社)。

1.3 十全育真汤煎液

十全育真汤由野台参12 g、生黄芪12 g、生山药12 g、知母12 g、玄参12 g、生龙骨12 g(捣细)、生牡蛎12 g(捣细)、丹参6 g、三棱4.5 g及莪术4.5 g组成，煎液由湖北民族学院附属民大医院药剂科提供，相当于生药30%(2 g/ml)的液体,瓶装密封消毒贮存于4℃备用。

1.4 动物造模、分组及给药

瘤源动物为H22细胞在小鼠体内传代3次，于最末次传代7 d后的腹水小鼠，选择状态好、腹水多的小鼠抽取3 ml腹水，显微镜下血细胞计数细胞数约为2.0×108cells/ml。取1 ml腹水用灭菌生理盐水配成细胞悬液，镜下细胞计数，调整细胞浓度为2.0×107cells/ml作为接种用瘤液。精确称量30只SPF级雄性昆明种小鼠，75%乙醇对左腋下消毒，皮下注射接种用瘤液0.2 ml[5，6]，制成荷H22小鼠肝癌细胞移植瘤模型。接种24 h后将小鼠随机分为模型组、阳性对照组及十全育真汤组(n=10)，另选择未接种小鼠10只为正常对照组。正常对照组、模型组每天按10 ml/kg分别灌胃生理盐水及蒸馏水，阳性对照组、十全育真汤组每天按8 g/kg、18 g/kg灌胃参一药液(80 mg/ml)与十全育真汤剂。各组自由饮食，连续给药14 d[7]。

1.5 小鼠一般行为学观察，胸腺、脾脏指数及抑瘤率的测定

每日给药前观察并记录各组小鼠体重、精神、活动、饮食及毛色等情况。末次给药24 h后精确称量各组小鼠，75%乙醇消毒，眼眶取血后断颈处死，小心取出肿瘤组织、胸腺、脾脏，放入冰冻生理盐水冲洗拭干，迅速用精密分析天平称取重量，测定胸腺、脾脏指数[胸腺、脾脏质量(mg)/体重(g)]与抑瘤率(1-给药组肿瘤质量/模型组肿瘤质量×100%)。

1.6 外周血白细胞、淋巴细胞及T淋巴细胞亚群检测

先于进样管中加入20 μl荧光抗体，然后加入100 μl抗凝血，低速离心静置15 min，加入稀释的溶血素450 μl，稍稍低速离心后静置10 min，用流式细胞仪对白细胞及淋巴细胞进行分析[6]。取100 μl小鼠EDTA抗凝血于流式细胞检测管中，分别加入用PE标记抗小鼠CD3、CD8及用FITC标记抗小鼠CD4荧光抗体各2 μl，充分混匀，避光反应15 min后加入100 μl红细胞裂解液，混匀充分反应12 min，然后再分别加入1 ml PBS，1 000 r/min离心6 min，取上层液体加入0.5 ml PBS后流式细胞仪检测分析T淋巴细胞亚群[8]。

1.7 ELISA法检测血清中IL-2、TNF-α及IFN-β含量

小心收集小鼠血液于无内毒素、热原的促凝管中，4℃，10 000 r/min离心15 min， -20℃保存备用。血清中IL-2、TNF-α及IFN-β含量检测参考试剂盒说明书采用双抗体夹心ELISA法。

1.8 小鼠脾淋巴细胞增殖能力及NK细胞杀伤功能的检测[9]

无菌条件下小心将脾脏放于离心管中加入淋巴细胞分离液中研磨，将悬有淋巴细胞的分离液转移到另外离心管中，加入RPM1640培养基1 ml，2 000 r/min离心12 min。吸出淋巴细胞层，经培养基洗涤后1 200 r/min离心15 min，最后用RPM1640将细胞浓度调至2×106cells/ml备用。脾淋巴细胞增殖能力检测：取100 ml脾淋巴细胞悬液于96孔细胞培养板中，并加入100 μl浓度为10 μg/ml的ConA置于37℃、5% CO2培养箱中培养2 d，然后加入CCK-8溶液10 μl，继续培养4 h，最后检测每孔吸光度。自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)功能检测：把制备好的脾淋巴细胞作为效应细胞(2×106cells/ml)，靶细胞为处于对数生长期的YAC-1细胞(1×105cells/ml)，用台盼蓝检测活细胞数，每个样品在96孔板上设3个复孔，各孔加入细胞悬液50 μl。另外设6孔，分别加入100 μl单纯靶细胞和效应细胞。置于37℃、5%CO2培养箱中培养3 d后每孔加入MTT 10 μl，继续培养4 h，然后每孔加入150 μl二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，振荡混匀12 min后酶标仪检测，并计算NK细胞活性。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 十全育真汤对荷瘤小鼠一般行为学，胸腺、脾脏指数及抑瘤率的影响

模型组小鼠在后期饮食量显著减少、毛色差、无光泽，其它各组则无明显改变；精神状况模型组小鼠在后期呈现出萎靡不振、不活泼，其它各组小鼠则活泼、精神状况良好，仅阳性对照组与十全育真汤组各有一只小鼠精神萎靡不振。十全育真汤对小鼠体重(增量)、胸腺、脾脏指数及抑瘤率的影响如表1所示，较正常对照组，模型组与十全育真汤组体重增量明显增大；阳性对照组与十全育真汤组脾脏指数显著增大(P<0.05)。与模型组相比，正常对照组小鼠体重增加量要明显低于模型组(P<0.05)，其它二组则无显著性差异；阳性对照组、十全育真汤组胸腺、脾脏指数显著增大(P<0.05)。阳性对照组、十全育真汤组都能显著影响小鼠的肿瘤增长，抑瘤率阳性对照组要高于十全育真汤组。

2.2 十全育真汤对小鼠外周血白细胞、淋巴细胞及T淋巴细胞亚群的影响

外周血经细胞流式仪检测，白细胞与淋巴细胞数量及CD3、CD4及CD8的百分比。较正常对照组，模型组、阳性对照组及十全育真汤组白细胞、淋巴细胞CD4及CD8含量均显著升高，阳性对照组及十全育真汤组CD3含量明显升高(P<0.05，表2)；与模型组比较，正常对照组、阳性对照组及十全育真汤组白细胞、淋巴细胞CD3含量，阳性对照组及十全育真汤组CD4含量明显升高(P<0.05)，CD8含量则显著降低(P<0.05，表2)。

GroupWeightbeforedrugdelivery(g)Weightexcisdtumorafteradministration(g)Weight(g)Thymusindex(mg/g)Spleenindex(mg/g)Tumorinhibitionrate(%)Normalcontrol25.86±2.1332.58±3.854.25±0.823.35±1.315.13±0.92-Model25.45±2.2430.18±5.784.87±0.68*2.57±1.146.82±2.32-Positivecontrol25.28±2.5431.75±4.064.59±1.423.41±1.45*#15.12±4.38*#51.43Shiquanyuzhentang26.08±2.3131.24±4.384.98±1.83*3.35±1.38*#14.68±4.46*#46.37*

*P<0.05vsnormal control group；##P<0.05vsmodel group

GroupLeukocytes(×109/L)Lymphocyte(×109/L)CD3(%)CD4(%)CD8(%)Normalcontrol8.24±0.786.51±0.6934.7±1.717.5±1.28.1±1.5*Model4.31±0.76*3.08±1.23*30.8±1.4*21.1±1.5#18.3±0.6Positivecontrol5.91±0.94*#4.89±0.63*#46.1±2.5*#32.9±2.7*#11.6±1.3*#Shiquanyuzhentang5.53±0.81*#4.68±0.56*#45.8±2.2*#31.4±2.1*#10.8±0.8*#

*P<0.05vsnormal control group；##P<0.05vsmodel group

2.3 十全育真汤对小鼠血清中IL-2、TNF-α及IFN-β含量的影响

ELISA法检测外周血中IL-2、TNF-α及IFN-β含量。较正常对照组，阳性对照组与十全育真汤组IL-2、IFN-β含量显著下降，TNF-α含量明显升高(P<0.05)；与模型组相比，正常对照组、阳性对照组及十全育真汤组IL-2、IFN-β含量都有显著增加(P<0.05)，正常对照组TNF-α含量明显降低，十全育真汤组TNF-α含量明显升高(P<0.05，表3)。

GroupIL-2(pg/ml)TNF-α(μg/ml)IFN-β(pg/ml)Normalcontrol81.74±14.651.11±0.1851.46±2.67Model65.61±4.13*1.53±0.21*40.35±4.21*Positivecontrol73.22±9.71*#1.73±0.24*45.35±3.43*#Shiquanyuzhentang72.63±10.97*#2.19±0.16*#44.74±3.52*#

IL-2: Interleukin 2; TNF-α: Tumor necrosis factor α; IFN-β: Interferon-β

*P<0.05vsnormal control group；##P<0.05vsmodel group

2.4 十全育真汤对小鼠脾淋巴细胞增殖能力及NK细胞杀伤功能的影响

小鼠脾淋巴细胞增殖能力及NK细胞杀伤功能的检测。较正常对照组，阳性对照组与十全育真汤组淋巴细胞增殖能力、NK细胞杀伤功能明显升高(P<0.05)；与模型组相比，正常对照组、阳性对照组及十全育真汤组NK细胞杀伤功能显著增加(P<0.05)，正常对照组淋巴细胞增殖能力明显降低，阳性对照组与十全育真汤组淋巴细胞增殖能力明显升高(P<0.05，表4)。

GroupLymphocytes(A)NKcell(%)Normalcontrol0.44±0.1453.11±22.18Model0.51±0.23*41.53±20.21*Positivecontrol0.92±0.11*#75.73±14.24*#Shiquanyuzhentang0.83±0.09*#67.19±13.16*#

*P<0.05vsnormal control group；##P<0.05vsmodel group

3 讨论

大多数抗肿瘤化学药物由于缺少选择作用，患者在接受放疗、化疗的同时，机体免疫系统也受到不同程度的损伤。肿瘤的发展与机体的免疫能力息息相关，肿瘤会影响机体的免疫功能，同时机体的免疫力对肿瘤又有抑制作用[8,10]。提高机体的免疫功能，增强机体自身抗肿瘤免疫反应在治疗肿瘤中极为重要[9]。中药配合治疗肿瘤，不仅可以减轻不良反应，治疗效果也有明显提升，这对加强中药在抗肿瘤机制方面的基础研究具有重要意义[11，12]。十全育真汤为张氏治阴虚劳热方，张氏认为虚劳之因在于气血迟滞，治虚劳必先治血痹，据此拟定十全育真汤[3]。此方具有益气养阴，活血化瘀之功，虚瘀同治、补消兼备，切合肿瘤在不断发展的同时，伴随明显的机体免疫功能下降的病理特点。

目前认为细胞免疫是机体抗肿瘤的主要免疫机制，体液免疫协同，其中T细胞介导的特异性免疫应答起着至关重要的作用。T 淋巴细胞亚群CD3+、CD4+及CD8+细胞是机体重要的免疫调控细胞[13，14]，当免疫功能失衡时CD3+、CD4+及CD4+/CD8+细胞水平会下降，CD8+细胞增多有利于肿瘤细胞的生长[15]。IL-2能激活、调节免疫细胞，参与体液免疫，通过促进T细胞的增殖与分化而产生抗肿瘤作用，还调节NK细胞，促进IFN-β等淋巴因子的分泌增强抗肿瘤活性；TNF-α在机体内正常情况下浓度较低，通过激活NF-κB或JNK信号转导通路调控肝细胞，具有抑制肿瘤增殖的作用，是目前发现抗肿瘤作用最强的细胞作用因子；IFN-β具有诱导肿瘤细胞凋亡、提高NK细胞、巨噬细胞等细胞对肿瘤细胞的杀伤水平，血清中IFN-β水平可作为评价机体抗肿瘤效应的指标[9，16]。机体抗肿瘤免疫反应中淋巴细胞也是极为重要，淋巴细胞的增殖是评价其抗肿瘤功能的指标，NK细胞作为抗肿瘤免疫中早期发挥作用的细胞，可直接杀死肿瘤细胞[9]。

本实验结果表明十全育真汤可不同程度提高H22荷瘤小鼠CD3+、CD4+细胞数量，减少CD8+细胞数量。有文献报道CD3+细胞减少及功能的下降还可导致IL-2分泌的减少[17]。本实验也发现H22荷瘤小鼠CD8+、CD3+细胞的减少及增多是显著的，IL-2含量与CD3+细胞的改变呈正相关，表明十全育真汤可以通过改善脾脏微环境来协调T细胞亚群失衡及免疫功能下降的问题，对平衡免疫功能有较好的作用。实验研究结果还显示出十全育真汤对H22荷瘤小鼠淋巴细胞、NK细胞的杀伤功能增殖显著，刺激机体分泌IFN-β。表明十全育真汤可激活淋巴细胞，对肿瘤细胞损伤NK细胞有较好的保护作用，诱导肿瘤细胞凋亡，增强机体抗肿瘤能力是有效的。

综上所述，十全育真汤对H22荷瘤小鼠的免疫系统有较好保护作用，能增强机体的免疫功能，提升抗肿瘤能力，有利于促进肿瘤机体的恢复。

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Effects of Shiquanyuzhentang on immunologic function of H22tumor-bearing mouse

ZHU Yun-chao△， ZHAN Guang-jie， YUAN De-pei， YANG Fu-ming， HUANG Qiong

(School of Medical Science, HuBei University for Nationalities， Enshi 445000， China)

Objective: To investigate the effects of Shiquanyuzhentang (Traditional Chinese Medicine) on the immunologic function of tumor-bearing mice and its mechanism of antitumor. Methods: Thirty SPF grade male Kunming mice transplanted with H22hepatocellular carcinoma were divided into three groups randomly：model group，positive control group and Shiquanyuzhentang group(n=10). Another 10 mice were selected as normal control group. Normal control group and model group received normal saline and distilled water supplementation by 10 mL/kg everyday. Positive control group and Shiquanyuzhentang group received Shengyi(80 mg/ml)and Shiquanyuzhentang decoction at the doses of 8 g/kg and 18 g/kg respectively everyday. After 14 days of continuous administration, the mice were killed and the thymus, spleen index, tumor inhibition rate，peripheral blood leukocytes，lymphocyte content，cell percentage of T cell subsets CD3, CD4, CD8，interleukin 2(IL-2)in serum，tumor necrosis factor-α(TNF-α)，interferon β (IFN-β) content，lymphocyte proliferation ability and NK cell were measured. Results: Compared with normal control group, the weight of mice and thymus and spleen index of the Shiquanyuzhentang group were increased significantly(P<0.05)；leukocyte and lymphocyte CD3、CD4、CD8 and TNF-α were increased greatly(P<0.05)，IL-2 and IFN-β were decreased significantly(P<0.05). Compared with model group，thymus and spleen index of Shiquanyuzhentang group were increased significantly(P<0.05)；leukocyte and lymphocyte CD3、CD4、IL-2、IFN-β and TNF-α of Shiquanyuzhentang group were increased significantly(P<0.05)，CD8 content was decreased significantly(P<0.05)；NK cell and lymphocyte proliferation were increased significantly(P<0.05). Conclusion: Shiquanyuzhentang can promote the growth of immune organs in mice bearing H22, enhance immune function and is beneficial to the recovery of tumor body.

Shiquanyuzhentang； H22tumor-bearing mouse； immunity

国家中医药管理局公共卫生专项资金项目(财社〔2010〕91号)；湖北民族学院博士科研启动基金项目(MY2010B004)

2015-11-17 【修回日期】2016-10-25

R285.5

A

1000-6834(2017)01-051-05

△【通讯作者】Tel： 13972407721； E-mail： zhongzhen4002@163.com