FOXO1表达改变在糖尿病视网膜病变中的关联性研究

高春兰，陈 丽，王伟邦，张 鑫，邹晓燕，李 蕊，李 颖

·论 著·

FOXO1表达改变在糖尿病视网膜病变中的关联性研究

高春兰，陈 丽，王伟邦，张 鑫，邹晓燕，李 蕊，李 颖

目的 研究糖尿病视网膜病变(DR)患者FOXO1基因表达改变，进一步了解DR的发病机制，为DR的治疗提供新的基因靶点和依据。方法 收集眼科、内分泌科住院部及门诊糖尿病(DM)患者的临床资料，分为DR组110例，糖尿病正常眼底组(NDR)120例。以荧光定量PCR方法检测FOXO1 mRNA表达水平，用Western blot检测FOXO1蛋白表达水平。结果 DR组与NDR组相比，FOXO1 mRNA表达在DR组中显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；DR组中FOXO1蛋白表达水平水平相比较NDR组明显增高(P<0.05)。结论 FOXO1在DR中的表达明显改变，这可能为DR提供潜在的治疗靶点。

糖尿病视网膜病变；叉头状转录因子O1

目前，糖尿病(DM)患者人群呈现逐年上升的趋势[1]，我国已超越印度成为了世界上罹患糖尿病人数最多的国家，成人糖尿病患病率高达10.1%[2]。糖尿病作为一种终身性代谢疾病，血糖代谢紊乱及利用失衡易造成全身多处器官出现病理性改变[3]，如糖尿病视网膜病变(DR)、糖尿病周围神经病变、糖尿病肾病、糖尿病足等，使患者生活质量明显下降，严重危害患者身体健康。DR特征为视网膜微血管功能的异常，其眼底病变具有特异性改变，DR的发生、发展与代谢紊乱、遗传调控等因素密切相关[4-5]。近年来国内外许多研究表明，FOXO1广泛表达于重要的胰岛素感应器官，如胰腺、肝脏和脂肪组织等，主要参与肝脏的糖异生调节，调控胰岛素β细胞的功能成长，调控脂肪和肌肉的分化及代谢[6-8]，提示FOXO1基因可能为DR的易感基因。然而，FOXO1在DR中的作用机制尚不清楚，因此探讨FOXO1表达改变在DR中的作用，将有助于进一步了解DR的发病机制，为DR的治疗提供新的靶点和理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料:收集所有样本病例均近期未服用抗凝血药物，并排除肝肾功能不全、心脑血管疾病、急性和慢性感染患者。实验组(DR组)为2013年1月-2016年6月在本院眼科及内分泌科门诊、住院部确诊为2型糖尿病患者，DR分型采用2002年悉尼国际眼科学会议制定的DR国际分型，依据直接眼底镜检查、眼底拍片以及眼底荧光血管造影检查确诊患者为DR，共110例，男53例，女47例，年龄(60.21±2.59)岁。对照组(NDR组)为同期糖尿病正常眼底患者，符合1999年世界卫生组织糖尿病分型标准，均未发生糖尿病视网膜病变，共120例，其中男性57例，女性63例，平均年龄(62.83±3.62)岁。

1.2 方法:DM患者均进行问卷调查、生化检测和眼科专科检查。问卷调查包括患者年龄、性别、DM病程、饮食习惯、是否有家族史等，并进行空腹血糖、糖化血红蛋白等实验室生化检测项目；眼科专科检测包括裸眼视力、矫正视力、眼压、直接检眼镜眼底检查、散瞳后眼底拍片、眼底荧光血管造影等。

1.2.1 实验室基本指标检测：所有患者病史资料采集后，于早晨空腹采患者外周静脉血5 mL于促凝管中30 min后离心，分离出血清标本后，2 h内采用Olympus AU2700型全自动生化分析仪，分别检测各个样本空腹血糖、糖化血红蛋白等指标，其余血清-20 ℃冰箱保存留作检测FOXO1基因。

1.2.2 实时定量荧光PCR(qRT-PCR)法检测血液中FOXO1的表达： 根据Trizol 试剂盒说明书提取患者外周血RNA，用GeneBank 数据库查询基因序列，设计引物，FOXO1上游引物 5'-TGAAACCATTACATCATCAC-3'，下游引物 5'-ATTAGA ATGTCC GCT TCG-3'，产物长度为168 bp。PCR扩增程序:95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，共45个循环。并设空白对照和内参(GADPH)对照同体系扩增目的基因的相对量，根据公式2-△△Ct计算，△△Ct=[CtASPP2(待测样本)-CtGADPH(待测样本)][CtASPP2(校正样本)-CtGADPH(校正样本)]。

1.2.3 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测外周血中FOXO1蛋白表达： 取30 μg总蛋白加入上样缓冲液煮沸至变性，经SDS/PAGE凝胶电泳，电转移至PVDF膜，封闭后与1∶1 000稀释的一抗在4 ℃孵育过夜，再与1∶5 000稀释的二抗室温孵育2 h，PBST清洗3次，每次5 min，曝光。扫描分析使用凝胶图像分析成像系统，以目的条带面积灰度值做半定量检测标定结果。

2 结果

2.1 2组患者一般临床资料比较:2组患者在年龄、性别比例和空腹血糖比较差异无统计学意义，病程、糖化血红蛋白含量差异有统计学意义(P<0.05),提示病程及糖化血红蛋白含量与糖尿病发生视网膜并发症相关,见表1。

2.2 DR患者中FOXO1 mRNA的表达:为了明确FOXO1 mRNA 在DR患者外周血中的表达改变，用荧光定量PCR技术检测以了解其表达水平，与NDR组相比，DR组FOXO1 mRNA表达升高了1.93倍，差异有统计学意义(t=5.816，P<0.05)，提示在DR发生发展中FOXO1可能发挥了重要作用(图1)。

表1 2组患者各项指标的比较±s)

2.3 DR患者中FOXO1蛋白表达:用Western blot技术检测了FOXO1蛋白表达水平，DR组与NDR组相比FOXO1蛋白表达升高了2.93倍，差异有统计学意义(t=9.865，P<0.05)，与FOXO1 mRNA表达一致，进一步证实在DR中FOXO1可能发挥了重要的作用(图2)。

图1 各组外周血中FOXO1 mRNA的表达

图2 各组外周血中FOXO1 蛋白的表达

3 讨论

作为DM最常见且最严重的微血管并发症之一[9]，DR是一种以微血管瘤、血管通透性增加、血管闭塞及新生血管形成为主要表现的高度特异性糖尿病微血管病变，占2型糖尿病患者的30%左右，病变严重者会导致患者视力丧失，已成为糖尿病致盲的重要原因，且目前尚无良好的治疗方法[10]。研究表明[11]，2010年以来，我国DM患者大幅度增加，总人数超过1亿，成为全世界糖尿病患病人数增长最快的国家，且糖尿病患者致盲率是非糖尿病患者的25倍之多[12]。同时，流行病学调查[13]已经证实，DR的发病率与DM病程关系密切呈正相关性，病程达15年以上的患者中约60%出现眼部血管病变，临床表现为视物模糊、视力下降等，严重者可导致失明；不但降低了患者生活质量，造成不可挽回的视觉伤害，同时也为社会带来了沉重的经济负担，现已成为了社会公共健康问题。

FOXO1是胰岛素信号下游的转录因子，广泛表达于重要的胰岛素感应器官，在肝脏和脂肪组织的胰岛素信号传递中发挥非常重要的作用，可以调节β细胞分化与增殖、脂肪和葡萄糖的代谢等[8,14]。有研究表明，FOXO1在糖尿病及其并发症的发生发展过程中发挥着重要的作用，FOXO1 可以通过调节糖异生相关基因的表达，对肝脏组织中的糖代谢进行调节，对维持正常的血糖水平起着重要的作用[15]。FOXO1蛋白能够通过与糖异生关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)基因启动子的胰岛素反应元件(IRE)结合，调节这两种基因的表达，可见FOXO1在糖尿病的病程进展中具有重要作用。本研究收集大量临床资料，并采集临床标本，对患者外周血中FOXO1的mRNA及蛋白水平进行了检测，发现DR组相较于NDR组FOXO1的表达显著增高，从转录和翻译两个水平证实了FOXO1表达改变在DR的发生发展中可能起到关键作用，其具体机制有待进一步研究。

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The study on FOX O1 expression in diabetic retinopathy

GAOChunlan,CHENLi,WANGWeibang,ZHANGXin,ZOUXiaoyan,LIRui,LIYing.

DepartmentofOphtalmology,TheFirstPeople’sHospitalofYinchuan,Yinchuan750001,China

Objective The study the of forkhead box transcription factor O1 (FOXO1) expression in patients with diabetic retinopathy (DR),provide experiment evidences for further explore the mechanisms of DR developing and target therapy of for DR.Methods The glycosylated hemoglobin content were measured check-ups and ophthalmology with automatic biochemical analyzer；the protein and mRNA expressions of FOXO1 were detected by western blotting and real time polymerase chain reaction (RT-PCR).Results General data analysis presents that the course of the disease is longer in DR group.Compared with the NDR group,the mRNA and protein expressions of FOXO1 in DR were increased obviously (P<0.05).Conclusion FOXO1 may taken part in the developing of DR,these found may provide an potential therapy target for DR.

Diabeticretinopathy；ForkheadboxtranscriptionfactorO1

10.13621/j.1001-5949.2017.03.0206

宁夏自然科学基金资助项目 (NZ14238)

宁夏银川市第一人民医院眼科，宁夏 银川 750001

高春兰(1974-)，女，副主任医师，硕士学位，从事眼科基础研究及临床工作。

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170313.0934.008.html

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A

2016-06-20 [责任编辑]王凯荣