先天性静止性夜盲家系和无色素性视网膜色素变性家系临床表型及突变基因的研究

刘雅妮，陈 雪，庄文娟

·论 著·

先天性静止性夜盲家系和无色素性视网膜色素变性家系临床表型及突变基因的研究

刘雅妮1,2，陈 雪3，庄文娟1,2

目的 研究先天性静止性夜盲家系和无色素性视网膜色素变性家系的致病基因突变及临床表型特征。方法 收集在宁夏眼科医院就诊的1个先天性静止性夜盲(CSNB)和1个无色素性视网膜色素变性(RPSP)家系的临床资料，抽取患者家庭成员及其正常对照者外周静脉血，提取DNA；运用外显子结合目标区域捕获测序芯片进行检测，对检测结果进行分析后得到候选致病性突变位点。运用PCR和直接测序进行验证，确定致病性突变位点。结果 CSNB 家系有3例患者，自幼夜盲，无进行性加重，ERG表现为暗视ERG，即a波正常、b波显著下降；EOG正常。RPSP家系有3例患者，自幼夜盲，逐渐加重。ERG检查与暗视ERG，a波、b波均重度下降；EOG显示光峰/暗谷明显降低。通过基因检测和生物信息分析，证实TRPM1基因p.R1025L为该家系的致病基因突变，MERTK基因p.R1443W为RPSP家系的致病基因突变。结论 先天性静止性夜盲及无色素性视网膜色素变性根据眼底表现难以鉴别，ERG、EOG检查及结合基因突变检测分析，可为临床诊断提供可靠依据。

先天性静止性夜盲；无色素性视网膜色素变性；TRMP1；MERTK

先天性静止性夜盲(CSNB)是一种少见的具有遗传性的、非进展性的视网膜病变。临床特点为先天性的非进行性夜盲，主要以视杆细胞的功能异常，从而导致夜视力受损，而明视觉通常并无明显异常为特征，伴有或者不伴有斜视、屈光不正和眼球震颤等临床表现，其暗适应及视网膜电图(ERG)发生特征性的改变[1]。无色素性视网膜色素变性(RPSP)患者眼底的表现除无典型性骨细胞样色素沉着以外，其眼底表现与典型性视网膜色素变性相同，即视网膜色污浊、动静脉血管均变细、视盘颜色蜡黄等；眼底荧光素血管造影表现为弥散性椒盐状透见荧光，未见骨细胞样遮蔽荧光[2]。CSNB 和RPSP虽都有夜视力障碍，由于临床症状轻微或患者在现代人工照明的夜环境中，没有意识到夜盲症状；患者就诊时，如无夜盲主诉，临床医生不做电生理检查，常常漏诊或者误诊。而CSNB与RPSP疾病的远期症状，转归明显不同。本文收集的CSNB与RPSP家系临床资料，结合突变基因检测，研究CSNB与RPSP家系的致病基因突变及临床表型特征。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选择2014 年就诊于宁夏眼科医院的1个CSNB家系及 1个RPSP家系患者作为研究对象。所有患者及其家庭正常成员均进行全面的眼科检查，包括最佳矫正视力、视野、眼底照相、光学相干断层扫描(OCT)、全视野视网膜电流图(ERG)及眼电图(EOG)检查；记录患者的家族史、婚育史及全身其他疾病史，确定遗传方式。正常对照组为200例无血缘关系的正常健康成年人，年龄均>60岁，除患有轻度的年龄相关性白内障外无其他眼科疾病。根据赫尔辛基宣言，所有研究对象均签署由本院伦理委员会批准的知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取：采集外周抗凝血5 mL，利用Qiamp Blood试剂盒(德国QIAGEN公司)提取全基因组DNA。DNA浓度≥50 mg/L，纯度OD 260/280为1.8～2.0，DNA总量≥6 μg。

1.2.2 外显子结合目标区域捕获测序：运用外显子结合目标区域捕获测序芯片技术，从每个家系选取的先证者和1名家庭正常人员进行目前已知的189个视网膜疾病的相关基因进行排查。该芯片是由罗

氏NimbleGen公司基于HD2平台2.1 M外显子序列捕获微阵列芯片设计，包含179个和视网膜疾病相关的基因及U4/U6-U5三个小核糖核蛋白复合体中与编码前体RNA剪切相关的10个基因。该芯片共包含4 641个外显子，利用Nimble Gen外显子捕获系统和Illuminated Hiseq 测序平台进行高通量测序(BGI，华大基因研究院)。

1.3 统计学方法：数据统计包括基本数据和生物信息分析，检测结果优先关注其编码区位点，并结合遗传方式确定候选致病性的突变位点。运用PCR及直接测序方法在家系其他人员和正常对照组中进行验证，最终确定致病性的突变位点。

2 结果

2个家系共收集到患者6例(图1)，正常家庭成员4名。

图1 两种家系图谱

2.1 CSNB家系：3例患者均为女性，患者视野及EOG检查均正常。先证者就诊时自诉自幼夜盲，无进行性加重，色觉正常，屈光状态(表1)，眼底表现为豹纹状眼底改变，视盘颞侧萎缩弧，黄斑区结构未见异常(图2，目录后)。ERG检查：暗适应0.01 ERGb波呈熄灭型； 暗视3.0 ERG：a波、b波重度下降；明视3.0 ERG:a波和b波重度下降(表2)。先证者其大姐眼底基本正常，黄斑中心凹厚度右眼219 μm、左眼197 μm。先证者其二姐眼底表现豹纹状眼底改变，视盘颞侧萎缩弧，黄斑中心凹厚度为右眼206 μm、左眼237 μm。

表1 CSNB和RPSP家系6名患者临床资料

2.2 RPSP家系：3例患者也均为女性。先证者自诉自幼夜盲，逐渐加重，白天视力明显下降，色觉检查为蓝色盲，屈光状态(表1)；眼底表现为视盘色偏白，血管细，黄斑区神经上皮层萎缩、椭圆体带消失，周边网膜可见少量骨细胞样色素沉着(图3，目录后)。ERG检查：暗适应0.01 ERGb波呈熄灭型； 暗视3.0 ERG：a波、b波重度下降；明视3.0 ERG:a波和b波重度下降；EOG：光峰/暗谷明显降低。其妹主诉自幼夜盲，且逐渐加重，白天视力明显下降，色觉检查为全色盲，眼底表现为视盘色可，血管细，黄斑区神经上皮层萎缩、椭圆体带消失，黄斑中心凹厚度右眼130 μm、左眼138 μm。其姐主诉自幼夜盲，且逐渐加重，白天视力明显下降，色觉检查为蓝色盲，眼底表现为视盘色白，血管细，黄斑区神经上皮层萎缩、椭圆体带消失，黄斑中心凹厚度右眼133 μm、左眼129 μm。3例患者后极部均未见骨细胞，周边网膜可见少量骨细胞样色素沉着。

表2 CSNB家系先证者ERG结果

2.3 致病基因突变分析：利用外显子&目标区域捕获测序芯片、PCR和直接测序的方法以及生物信息分析，同时结合遗传方式和患病特点，最终确定TRPM1基因p.R1025L为CSNB家系家系的致病基因突变，MERTK基因p.R1443W为RPSP家系的致病基因突变(基因改变)，见表3。

表3 CSNB和RPSP家系外显子结合目标区域测序结果

3 讨论

CSNB与RPSP均属遗传性视网膜营养不良性疾病，临床特点都有夜盲、白昼视力正常或下降，视野异常，眼底周边视网膜无或仅有极少色素沉着。二者均有共同的致病基因，即RHO、PDE6B、SAG，但其ERG及EOG明显不同：CSNB暗视ERGa波正常或接近正常，b波显著下降甚至消失，b波和a波的振幅比<1；EOG正常。RPSP 暗视ERG：a波、b波振幅均下降或消失；EOG：光峰/暗谷明显降低或消失，其致病基因也有差异。

CSNB，国内相关报道较少。由于相当部分患者无夜盲主诉使得CSNB患者易漏诊或误诊，这和患者缺少特异性临床症状、眼底视网膜结构正常有关。CSNB这一疾病具有遗传异质性，患者均自幼发病，白昼视力正常，夜盲症状无进展。根据孟德尔遗传方式，可以将CSNB分为常染色体显性遗传型(AD 型)，常染色体隐性遗传型(AR 型)及性连锁隐性遗传型(XL 型)。不同遗传方式的CSNB临床表现具有一定差异，但其功能上均主要以视杆系统严重损害为特征；AD型的患者其视力大多为正常，而明适应、视野、色觉正常或轻度异常，不合并近视的症状。AR型及XL型的患者通常伴有近视，同时也可以合并视盘斜视或眼球震颤。AR 型的患者其矫正视力大多为0.2～0.5，而XL型的患者甚至会出现豹纹状眼底、视盘倾斜及视盘周边萎缩弧，这一型的患者最佳矫正视力通常为0.4～0.5，也可以到0.1～0.8。视觉电生理的检查是CSNB诊断及分型的重要依据，根据ERG的改变，可将CSNB分为两种类型，即Schubert-Bornschein型(负相型)及Riggs型。Schubert-Bornschein型患者其暗视白光ERG中的a波正常或者接近正常，而b 波的振幅表现为显著下降或消失，同时b波及a波的振幅比<1，所以将其又称为负相波。根据其ERG的改变可以推测出其病变的部位，在视网膜的双极细胞区域并靠近外丛状层，这一型的患者其眼电图(EOG)表现为正常。本文收集的CSNB患者均有自幼夜盲、无明显加重的主诉，其中2例表现为中高度近视，眼底表现为豹纹状眼底、视盘倾斜及视盘周围萎缩弧；1例为低度近视，3例矫正视力均明显低于正常视力，为0.3～0.6，符合文献报道的AR型患者的临床表型。先证者ERG表现为暗视ERG，即a波正常、b波显著下降，b波和a波的振幅比<1；EOG正常，表现为典型Schubert-Bornschein 型(负相型)，该家系诊断为CSNB，诊断明确，同时基因的检测TRPM1基因p.R1025L的改变也验证了该诊断的正确性。目前为止，已有15个基因和CSNB有关(https://sph.uth.edu/RetNet/)，AR 型CSNB非常少见，TRPM1基因改变可以引起ARCSNB。TRPM1 属于瞬时性感受器电位(TRP)通路家族的成员，该基因可改变视网膜ON 双极细胞中细胞质内游离的Ca2+水平，从而在视网膜神经传递中起作用[3]。由TRPM1基因改变引起的CSNB疾病在国内未见报道。近年来，庄树林等[4 ]对中国人群一ADCSNB大家系进行了研究，但均未发现任何突变。而王凤羽[5]等发现的RHO基因Thr94Ile突变为国内首次报道。在该家系患者的RHO基因中发现了1个C.281C>T的杂合错义点突变，该突变在蛋白质水平将导致P.Thr94Ile的改变。睢瑞芳等[6]对X连锁CSNB家系研究，发现家族中所有患者NYX基因外显子2发生了错义突变，核苷酸772位的腺嘌呤被胞嘧啶取代(A772c)，对应的苏氨酸改变为脯氨酸(T258P)。

相对于CSNB的RP研究较为成熟。本文收集RPSP患者均自幼夜盲，逐渐加重，白天视力明显下降，色觉检查为蓝色盲，眼底表现除无明显骨细胞样色素沉着外表现为典型的RP眼底改变：视盘色白，血管细，黄斑区色素上皮层萎缩、椭圆体区消失；先证者ERG检查：暗适应0.01 ERGb波呈熄灭型； 暗视3.0 ERG：a波、b波均重度下降；明视3.0 ERG：a波和b波重度下降；EOG：光峰/暗谷明显降低。该家系诊断RPSP明确，外显子结合目标区域捕获测序检测出MERTK基因p.R1443W改变为该家系的致病基因。1992年以来，研究已发现的ARRP致病突变达30余种。仍有大量的ARRP患者不能明确致病基因[7]，MERTK基因位于2q 14.1，在RPE细胞中表达，参与RPE细胞吞噬视网膜外节膜盘的过程，其改变导致RPE吞噬通路的破坏[8]。欧美国家人群中，MERTK基因突变的频率为1%左右[9]，MERTK基因的研究也为目前RP基因研究的热点；韩菲[10]对在北京协和医院收集的110例ARRP/SRP进行基因研究，结果显示MERTK基因突变率为6.9%，共发现18种致病突变，1种错义突变，1种无义突变，6种移码突变，3种己报道，其中225delA，Gly76Glu，fsX3这一移码突变在4例患者6个DNA单倍体中出现，突变率较高。2例单眼发病的RP患者均存在MERTK基因突变。朱晓青[11]对收集的277例RP患者研究发现，MERTK基因在国人的致病率为1.6%，其发现的致病性突变为：c.225 DelA(p.Gly76GlufsX3)；c.797A>G(p.Asn266Ser)；c.1282A>G(p.Ser428Gly)；c.1669C>T(P.Arg557Trp。)

CSNB及RPSP虽从主诉及眼底表现难以鉴别，但依靠ERG及EOG可明确诊断，同时基因检测可也为临床诊断提供可靠依据。本研究应用的外显子结合目标区域测序方法是一种利用特制的探针，针对特定的蛋白编码区域DNA 或者特定的序列进行捕获，富集后进行高通量测序，具有高效率、低成本、短耗时的特点。本研究中收集到的两个家系均为隐性遗传疾病，理论上相应的基因突变检测中可为一个纯和突变，或者为两个同时出现的杂合突变。但是就本研究中家系而言，目前我们的基因芯片检测结果为可能致病的基因突变仅有一个位点，推测其原因为很多眼科相关疾病可遵循生殖细胞嵌合这种遗传模式，也有很多致病基因可以同时遵循显性遗传和隐性遗传两种遗传模式。为了更加全面地进行遗传学研究，其后我们将会辅助全外显子组测序及功能实验来进一步明确这两个家系的致病突变。

本课题靠外显子结合目标区域捕获测序检测出TRPM1基因的改变为CSNB的致病基因，丰富了国人的基因库；而MERTK基因虽国内已有报道，但目前已有应用基因替代疗法治疗MERTK基因突变引起的视网膜色素变性(RP)，期待我们的研究为该家系患者提供帮助。

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Studies the clinical phenotypes and mutation disease-causing geness of congenital stationary night blindness pedigree and retinitis pigmentosa sine pigmento pedigree

LIUYani1,2，CHENXue3，ZHUANGWenjuan1,2.

1.NingxiaEyeHospital,Ningxiapeople’sHospital,Yinchuan750002,China;2.TheFirstClinicalMedicalCollegeofNorthwestUniversityforNationalities,Yinchuan750002,China;3.DepartmentofOphtalmology,Jiangsupeople’sHospital,Nanjing210029,China

ZHUANGWenjuan,Email:zh-weng@163.com

Objective To study the disease-causing genes and clinical phenotypes of the congenital stationary night blindness pedigree and retinitis pigmentosa sine pigmento pedigree.Methods One congenital stationary night blindness pedigree and one retinitis pigmentosa sine pigmento pedigree were recruited for this study.All the patients and family members received complete ophthalmic examinations.DNA was abstracted from patients，family members and controls.Using exon combined target region capture sequencing chip to screen the candidate disease-causing mutations.Polymerase chain reaction(PCR)and direct sequencing were used to confirm the disease-causing mutations.Results 3 patients in the congenital stationary night blindness pedigree are nonprogressive blindness.ERG shows a normal a-wave but a striking reduction of the b-wave on the dark-adapted bright flash ERG，whose amplitude of the b-wave is smaller than that of the a-wave and responses to a single bright flash in the Schubert-Bornschein type of ERG pattern but a normal responses to EOG.3 patients of the Retinitis pigmentosa sine pigmento pedigrees are progressive nyctalopia blindness from an early age.ERG shows a striking reduction of both a-wave and b-wave on the dark-adapted bright flash ERG.p.R1025L heterozygous missense mutation on TRPM1 gene in congenital stationary night blindness patients was detected.p.R1443W heterozygous missense mutation on MERTK gene in RPSP patients was detected by means of genetic tests and bio-information analysis.Conclusions Congenital stationary night blindness and Retinitis pigmentosa sine pigmento is difficult to identify according to fundus appearance，ERG，EOG examination combined with gene mutation detection and analysis can provide a reliable basis for clinical diagnose.

CSNB；RPSP；TRMP1；MERTK

10.13621/j.1001-5949.2017.03.0196

国家自然科学基金资助项目(81460093)

1.宁夏人民医院眼科医院,宁夏 银川 750002 2.西北民族大学第一附属医院， 宁夏 银川 750002 3.江苏省人民医院眼科,江苏 南京 210029

刘雅妮(1979-)，女，主治医师，硕士研究生，从事眼科学临床及遗传学实验研究工作。

庄文娟：Email:zh-weng@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170313.0934.002.html

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A

2016-07-18 [责任编辑]王凯荣