枸杞多糖对体外培养的视网膜神经节细胞氧化应激损伤的保护作用

李 贞,张芳霞，马雅玲

·论 著·

枸杞多糖对体外培养的视网膜神经节细胞氧化应激损伤的保护作用

李 贞1，2,张芳霞1,2，马雅玲3

目的 观察枸杞多糖对体外培养的视网膜神经节细胞氧化应激损伤的保护作用。方法 实验分为正常对照组、H2O2组、H2O2+ LBP(40 mg/L)组。正常对照组：DMEM完全培养基常规培养；H2O2组：含体积分数10%FBS的DMEM高糖培养基培养，同时加入200 μmol/L H2O2溶液造成氧化应激损伤模型；H2O2+LBP(40 mg/L)组：用含10%FBS和200 μmol/L H2O2的DMEM培养基培养，同时加入不同浓度的枸杞多糖(10 mg/L，20 mg/L，40 mg/L)进行干预，最终选用40 mg/L枸杞多糖进行保护。使用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和AnnexinV-FITC法检测细胞存活率及凋亡率。结果 MTT结果显示，H2O2能够降低RGC-5细胞活性，并呈浓度依赖性，200 μmol/L H2O2作用24 h后RGC-5细胞活性为正常对照组的50%,继续加入不同浓度LBP (10 mg/L，20 mg/L，40 mg/L)干预后细胞存活率分别为52.5%、62.8% 和68.6%，与H2O2组相比较细胞存活率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。AnnexinV-FITC检测结果显示，正常对照组、H2O2组、H2O2+LBP(40 mg/L)组细胞凋亡率，分别为4.90%、32.35%、24.21%，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论 枸杞多糖对RGC-5氧化应激损伤有保护作用。

枸杞多糖；视网膜神经节细胞；细胞凋亡

青光眼是一类以特异性视神经萎缩和视野缺损为特征的致盲眼病[1]，严重影响患者的健康和生活质量。视网膜神经节细胞(RGCs)的进行性凋亡是青光眼最主要的病理生理学特征。保护视神经，阻止视网膜神经节细胞凋亡成为近年来的研究热点。枸杞多糖(LBP)是宁夏特色植物枸杞的主要有效成分之一，有多种药理学作用。RGC-5细胞是应用Ψ2E1A病毒转染出生后1 d大鼠RGC获得的永生细胞株[2]，近年来广泛用于RGCs的相关研究。本研究应用外源性活性氧(H2O2)制作RGC-5凋亡模型，用LBP进行干预，进而研究LBP对RGC-5的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器:LBP(40%，宁夏启元国药有限公司)，DMEM高糖培养基(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，MTT(Sigma)，AnnexinⅤ-FITC /PI 凋亡检测试剂盒(北京贝博公司)，水套式二氧化碳培养箱(HF160W)，酶标仪(美国BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠RGC-5细胞的培养:RGC-5细胞常规培养于10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃、体积分数5% CO2饱和湿度细胞培养箱中贴壁培养，隔日换液。显微镜下观察细胞生长情况，每2～3 d用2.5 g/L胰蛋白酶消化并按1∶2～1∶4进行传代。

1.2.2 H2O2诱导RGC-5氧化应激损伤模型的建立:将正常对照组和4个浓度H2O2组(50、100、200、400 μmol/L)分别培养24 h后，应用MTT法检测各组细胞存活率。不同浓度H2O2组细胞存活率分别为正常对照组的91.3%、87.6%、49.7%、26.5%，200 μmol/L H2O2组细胞存活率约为对照组的50%。本研究选用200 μmol/L H2O2建立RGC-5氧化应激损伤模型。

1.2.3 LBP对RGC-5氧化应激损伤的影响

1.2.3.1 实验分组:实验分为3组，即：正常对照组，只加DMEM培养液进行培养；H2O2组，除了DMEM高糖培养基外，加入浓度200 μmol/L H2O2溶液造成氧化应激损伤模型；H2O2+LBP(40 mg/L)组，用浓度为200 μmol/L的H2O2溶液作用24 h后，继续加入浓度为40 mg/L LBP培养24 h。

1.2.3.2 MTT法检测细胞活性:取对数生长期的RGC-5，将RGC-5细胞按每孔1.0×104个细胞接种至96孔板内，按照1.2.3.1中的方法进行干预，LBP(40 mg/L)作用24 h后每孔加入20 μl MTT溶液继续培养4 h；终止培养，吸去孔内培养液。每孔加入150 μl 二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪用490 nm波长处测量各孔的吸光度(A)，实验重复至少3 次。细胞存活率= 处理组A值/对照组A值。

1.2.3.3 Annexin V-FITC凋亡检测:将RGC-5 按各组以每孔2.0×106个接种于6孔板中，按照1.2.3.1中的方法进行干预。培养24 h后去除培养基，用冷PBS洗涤一次，用不含EDTA的胰酶消化，1 000 r/ min离心5 min；弃去上清，然后将细胞重悬于400 μl 1×Binding Buffer中，再加入10 μl Annexin V-FITC 4 ℃避光孵育15 min，加入5 μl PI于4 ℃避光孵育5 min。用流式细胞仪观察LBP对RGC-5凋亡的影响。

2 结果

2.1 RGC-5细胞形态学观察：将RGC-5细胞放于倒置相差显微镜下观察可见细胞接种4 h后即可贴壁生长，贴壁培养的RGC-5细胞有较短的突起，边缘清晰，细胞透亮、折光性好。显微镜下观察呈单层生长，见图1(目录后)。

2.2 MTT检测：分别用浓度为50、100、200、400 μmol/L的H2O2作用24 h，细胞存活率分别为91.33%、87.67%、49.68%、26.50%。200 μmol/L H2O2RGC-5细胞活性为对照组的50%，本实验选择此浓度H2O2建立视网膜神经节细胞氧化应激损伤模型。不同浓度LBP(10 mg/L、20 mg/L和40 mg/L)干预后，细胞存活率分别为52.5%、62.8%和68.6%，较H2O2组细胞活性明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。本实验采用40 mg/L LBP 进行保护，见表1。

表1 LBP对H2O2诱导的RGC-5细胞活性的影响±s)

注：*与正常对照组比较，P<0.05；#与H2O2组比较，P<0.05；◆与10 mg/L LBP组比较，P<0.05；★与20 mg/L LBP组比较，P<0.05。

2.3 Annexin V-FITC 凋亡检测：正常对照组细胞凋亡率为4.90%，200 μmol/L H2O2作用24 h，细胞凋亡率为32.35%，加入40 mg/L LBP干预后细胞凋亡率为24.21%，LBP组与H2O2组凋亡细胞所占比例差异有统计学意义(P<0.05)，见表2，图2(目录后)。

表2 LBP对H2O2诱导的RGC-5细胞凋亡率的影响±s)

注：#与正常对照组比较，P<0.05；*与H2O2组比较，P<0.05。

3 讨论

青光眼是世界范围内第二大致盲性眼病[3],以特异性视神经萎缩和视野缺损为共同特征[4]。目前认为青光眼致视功能损害的共同病理基础是视网膜神经节细胞的凋亡及其神经纤维的丧失，从而导致不可逆性视神经萎缩和视野改变[5]。因此阻止视网膜神经节细胞凋亡，保护视神经已成为近年来的研究热点。已有研究表明，青光眼的发生与氧化应激有关[6]。氧化应激(OS)是指氧化程度超出氧化物的清除能力，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。Ishisaka[7]等的实验表明，H2O2是一种细胞凋亡介质，其诱导细胞凋亡的途径就是引起机体氧化应激，H2O2作为一种细胞凋亡介质被广泛用于各种氧化应激损伤模型[8]。LBP是从宁夏特色植物枸杞中分离出的主要多糖之一。研究发现，LBP具有多种药理学作用，在抗凋亡、抗氧化、延缓衰老[9]、加强免疫功能、降低血糖[10]、清除自由基[11]中发挥重要的作用。本研究采用H2O2诱导RGC-5氧化应激损伤模型，应用MTT及Annexin V-FITC检测LBP对视网膜神经节细胞氧化应激损伤的保护作用。MTT比色法是最为常见的一种用来检测细胞活性的方法，其结果显示，200 μmol/L H2O2作用24 h后细胞存活率为49.68%，与正常对照组相比，造成约50%的RGC-5凋亡；不同浓度LBP(10 mg/L、20 mg/L和40 mg/L)进行干预后细胞存活率分别为52.5%、62.8%和68.6%，较H2O2组细胞存活率明显提高，并呈浓度依赖性，证明LBP能够提高细胞存活率，从而对氧化应激损伤的视网膜神经节细胞起到保护作用。本实验采用浓度为40 mg/L LBP来进行保护。AnnexinV/PI双染法是目前最为常用的一种检测细胞凋亡的方法,该方法具有灵敏度高、操作简便易行等特点。在流式细胞分析图中，正常细胞不能被AnnexinV及PI染色(AnnexinV-PI-)，位于图的左下区Q3区(LL)；早期凋亡的细胞可被Annexin V染色而不被PI染色(Annexin V+PI-)，分布在图的右下区Q4区(LR)；晚期凋亡细胞均能被Annexin V及PI染色(AnnexinV+PI+)，分布在图的右上区Q2区(UR)。本实验Annexin V-FITC 检测结果显示，H2O2组Q2和Q4区细胞明显多于正常对照组，即早期凋亡和晚期凋亡细胞明显增加，进一步证明H2O2诱导RGC-5细胞损伤为凋亡。40mg/L LBP进行干预后，细胞凋亡率为(24.21±4.56)%，与H2O2组的(32.35±5.17)%相比明显下降，差异有统计学意义。综上所述，本实验结果表明H2O2能够诱导RGC-5细胞发生凋亡，LBP则可以抑制H2O2对RGC-5造成的损伤，减少细胞凋亡，从而发挥视网膜神经保护作用。但是LBP能否作为一种临床可用的预防视网膜神经节细胞凋亡的治疗方法，还有待进一步研究。

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Effects of lycium barbarum polysaccharides therapy on oxidative stress-induced apoptosis of cultured retinal ganglion cells

LIZhen1，2,ZHANGFangxia1，2,MAYaling3.

1.NingxiaEyeHospital,NingxiaPeople’sHospital,Yinchuan750002,China;1.TheFirstClinicalMedicalCollegeofNorthwestUniversityforNationalities,Yinchuan750002,China;3.DepartmentofOphtalmology,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China

MAYaling,Email: myleye@163.com

Objective To investigate the neuroprotective effects of lycium barbarum polysaccharides (LBP) against oxidative stress-induced injury in cultured retinal ganglion cells.Methods Rat RGC line RGC-5 were cultured in vitro,and were randomly divided into the normal group,H2O2group and H2O2+LBP (40mg/L) group.Then apoptosis models were cultured a series concentration of LBP (10 mg/L,20 mg/L and 40 mg/L).Cell viability of the RGC-5 cell line was measured with MTT assay,flow cytometry was used to detect the apoptosis process.Results The results of MTT colorimetry showed that H2O2may induce cell death of RGC-5 cells in a concentration-dependent manner,exposure to 200 μmol/L H2O2clearly induced cell death in 50% of the cells within 24 hours,the survival ratio after exposure to 200μmol/L H2O2was lower than that in control cell.The survival ratio in LBP group (10 mg/L,20 mg/L,40 mg/L) were 52.5%,62.8% and 68.6%,respectively.There was statistical difference between 10 mg/L,20 mg/Land 40 mg/L group (P< 0.05).Flow cytometry showed apoptosis ratio of RGC-5 in control group,H2O2group and H2O2+LBP group were respectively 4.90%,32.35% and 24.21%，(P<0.05).Conclusion The study demonstrates that LBP can prevent RGC-5 from apoptosis.

Lyciumbarbarumpolysaccharides；Retinalganglioncells；Apoptosis

10.13621/j.1001-5949.2017.03.0193

宁夏自然科学基金资助项目(NZ13283)

1.宁夏人民医院眼科医院，宁夏 银川 750002 2.西北民族大学第一附属医院，宁夏 银川 750002 3.宁夏医科大学总医院眼科，宁夏 银川 750004

李贞(1989-)，女，甘肃籍，硕士研究生，住院医师，从事眼科专业工作。

马雅玲，Email:myleye@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170313.0934.004.html

R285

A

2016-06-18 [责任编辑]王凯荣