壮药排钱草总生物碱对大鼠肝星状细胞胶原和细胞因子生成的影响△

陈少锋 赵湘培 余胜民

(广西壮族自治区民族医药研究院，广西 南宁 530001)

壮药排钱草总生物碱对大鼠肝星状细胞胶原和细胞因子生成的影响△

陈少锋 赵湘培 余胜民

(广西壮族自治区民族医药研究院，广西 南宁 530001)

目的：研究排钱草总生物碱对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)相关胶原和细胞因子的分泌影响。方法：体外培养HSC-T6细胞，将排钱草总生物碱(终浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.625μg/mL)作用于细胞48h后，以MTT法检测细胞存活率，求出半数抑制浓度(IC50)，根据IC50选取无细胞度浓度进一步研究；收集细胞上清液，用ELISA法分别检测Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(COL-Ⅲ)、Ⅳ型胶原(COL-Ⅳ)、转化生长因子(TGF-β1)、血小板衍生因子(PDGF)的含量。结果：排钱草总生物碱能明显抑制HSC-T6细胞的增殖，其抑制作用与药物终浓度呈量效关系，求得IC50为337μg/mL；并显著降低HSC-T6 细胞生成的COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1，PDGF含量，与空白对照组比较，P<0.05或P<0.01。结论： 排钱草总生物碱对HSC-T6细胞增殖有显著抑制作用，并能降低COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、PDGF的含量。

排钱草总生物碱；HSC-T6；细胞因子

排钱草是广西、广东等地广泛应用的民间药材，是豆科植物排钱草Phyllodium pulchellum(L.)Desv.的干燥根。由于其具有清热利湿、活血祛瘀、软坚散结、除湿消肿等功效，因此常用于治疗肝炎、子宫脱垂、肝脾肿大、风湿痹痛、月经不调等症[1]。在针对肝纤维化的治疗中，前期已有药理研究证实排钱草有显著活性[2-6]，但均未对其抗纤维化机制深入研究，因此，本实验通过从细胞分子学水平研究排钱草总生物碱对大鼠肝星状细胞胶原合成及细胞因子的分泌的影响，为进一步研究其抗肝纤维化作用机制提供前期理论依据，对开发排钱草这一民族药资源具有重要意义。

1 材料

1.1 药物：排钱草，采自广西恭城瑶族自治县，经作者本人鉴定为豆科植物排钱草Phyllodium pulchellum(L.)Desv.的干燥根。

排钱草总生物碱：取排钱草粗粉加70%乙醇回流提取3次，每次1.5h，醇提液过滤，滤液回收乙醇至稠膏状，加1%盐酸溶解，过滤，滤液用三氯甲烷萃取，三氯甲烷液弃去，酸水液用氨水调PH9后用三氯甲烷萃取，三氯甲烷液回收三氯甲烷至稠膏状，得总生物碱，以蒸馏水配成实验所需浓度。

1.2 试剂：DMEM培养基(HyClone公司,批号：AAM210569)；胎牛血清(HyClone,批号：NVJ0313)；胰蛋白酶(Solarbio,批号：201611)；双抗(gibco公司,批号：15140-122)；四氮唑蓝MTT(Solarbio,批号：410C05)；COL-ⅠELISA Kit(Bio-Swamp公司,批号：201611)、COL-Ⅲ ELISA Kit(Bio-Swamp公司,批号：201611)、COL-Ⅳ ELISA Kit(Bio-Swamp公司,批号：201611)、TGF-β1 ELISA Kit(Bio-Swamp公司,批号：201611)、PDGF ELISA Kit(Bio-Swamp公司,批号：201611)。

1.3 仪器：倒置显微镜(LEICA DMIRB)；二氧化碳培养箱(美国Thermo)；超净工作台(荷兰ClearAir公司)；离心机(德国Biofuge Stoctos 公司)；连续波长酶标仪(上海科华实验系统有限公司，ST360)1.4细胞：HSC-T6细胞株由广西中医药大学药理教研室提供。

2 方法[7]

2.1 排钱草总生物碱对HSC-T6细胞增殖的影响：取对数生长期的 HSC-T6 细胞，用0.25% 胰酶消化，离心收集细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液将细胞浓度调成3×104个/mL，接种于96孔培养板板中，每孔100ul。细胞设空白对照组、6个不同浓度排钱草总生物碱组(终浓度为1000、500、250、125、62.5、31.25、μg/mL)，每组4个复孔。细胞接种后，在37℃，5%CO2培养箱预培养24h后，各组加入对应的药物浓度，空白对照组只加含DMEM 完全培养液，继续培养48h后，按照MTT法，于570nm波长处测每A值。测得的各复孔A值取平均值，计算细胞生长抑制率，根据抑制率求出IC50,根君IC50选取3个无细胞毒作用浓度进行后续实验。 抑制率=(1-药物A/对照A)×100%

2.2 排钱草总生物碱对HSC-T6 生成的COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、COL-Ⅳ、TGF-β1、PDGF含量的影响： 取对数生长期的 HSC-T6 细胞，用0.25% 胰酶消化，离心收集细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液将细胞浓度调成3×104个/mL，接种于96孔培养板板中，每孔100ul。细胞设空白对照组、阳性对照组(秋水仙碱,终浓度为1μg/mL)、及3个不同浓度排钱草总生物碱组(终浓度为150、75、37.5μg/mL)，每组 4 个复孔，细胞接种后于在 37℃，5%CO2培养箱培养24h后，药物组加入对应的药物浓度，空白对照组只加含DMEM 完全培养液，体积均为100ul，继续培养48h后，收集细胞上清液3000 r·min 离心10 min，取上清液，按ELISA 试剂盒操作说明书检测COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、COL-Ⅳ、TGF-β1、PDGF含量。

2.3 统计学方法： 实验数据采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，计量数据以()表示，两组间均数比较用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 排钱草总生物碱对HSC-T6细胞增殖的影响：由表1提示，排钱草总生物碱16.625～500μg/mL浓度范围内，对HSC-T6细胞增殖有明显抑制作用，且呈剂量关系，求出排钱草总生物碱对HSC-T6细胞半数抑制浓度IC50为337μg/mL。

表1 排钱草总生物碱对HSC-T6细胞增殖的影响

注：与正常对照组比较，*P<0.05；**P<0.01；

3.2 排钱草总生物碱对对HSC-T6 生成的COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、COL-Ⅳ、TGF-β1、PDGF含量的影响：由表2提示，排钱草总生物碱在终浓度为75μg/mL时，能抑制HSC-T6 细胞生成COL-Ⅲ含量，与空白组照比较，有显著差异(P<0.01)；当排钱草总生物碱在终浓度为150μg/mL时，能抑制HSC-T6细胞生成COL-Ⅰ、COL-Ⅲ胶原和TGF-β1、PDGF细胞因子的含量，与空白组照比较，有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。

表2 排钱草总生物碱对COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、COL-Ⅳ、TGF-β1、PDGF含量的影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

4 讨论

大多数慢性肝病共有的病理特征是肝纤维化，它也是慢性肝炎、肝硬化进一步发展并恶化的一个重要环节。有资料表明，肝纤维化患者中，会有20%～40%最终会发展成为肝硬化甚至肝癌。广西是肝病的高发绿地区，有效地抑制肝纤维化的发生以及发展，对防治肝硬化甚至肝癌就具有及其重要的意义。肝纤维化的发生与肝细胞外间质ECM成份的合成与降解、细胞因子的调节及许多细胞(主要以贮脂细胞)的参与有关。胶原蛋白作为组成 ECM 的主要成份，在肝纤维化的形成中具有重要意义。目前已发现27种胶原分子[8]，其中以COL-I、COL-Ⅲ、COL-Ⅳ为主，是肝纤维形成的重要标志。Ⅳ型胶原主要由肝窦内皮细胞产生，是基膜的主要胶原成分，在肝纤维化早期阶段产生，并启动参与肝纤维化的各种因子，继而导致Ⅰ、Ⅲ型胶原沉积。在肝纤维化早期以COL-Ⅲ为主，而到肝纤维化后期则主要是COL-I为主。因此抑制胶原的异常合成、促进沉积胶原的降解，在预防与治疗肝纤维化中起着十分重要的作用[9-10]。 已有研究表明了HSC激活的调节的过程有多种因子参与，但TGF-β和PDGF是分别引起肝纤维化和细胞增生的关键，是最重要的细胞因子[11-12]。当 HSC 活化时，它失去类维生素A，并开始表达新的受体，主要为PDGF 受体和TGF-β受体。活化的 HSC 通过自分泌和旁分泌 PDGF、TGF-β，促进 HSC 增殖，合成大量 ECM 并在肝内沉积，产生纤维化瘢痕，导致肝纤维化[13-14]。因此，通过抑制TGF-β和 PDGF诱导的 HSC 细胞增殖能有效的减少甚至逆转肝纤维化。通过本实验研究发现，排钱草总生物碱对T6细胞的增殖有明显的抑制作用，并能显著降低T6细胞分泌的 COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、胶原含量，及细胞因子TGF-β1、PDGF含量，与空白对照组比较有显著性差异，说明在排钱草总生物碱抗肝纤维的作用机制与胶原蛋白与细胞因子合成有关，其具体机制可进一步研究。

[1]江苏新医学院．中药大辞典:下册[M]．上海:上海科学技术出版社,1986:2092．

[2]钟鸣,黄琳芸,余胜民,等.排钱草对大鼠实验性肝纤维化的影响[J].中西医结合肝病杂志,1999,9(4):22-24．

[3]余胜民,钟 鸣,黄琳芸,等.排钱草对实验性肝纤维化大鼠肝脏胶原蛋白含量的影响[J].湖南中医药导报,1999,5(8):36-37.

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2017年1月24日收稿

Effect of Desmodium pulchellum(L.) benth Total Alkaloids on HSC-T6 Cell Proliferation and Content of Collage and Cytokine

CHEN Shao-feng ZHAO Xiang-pei YU Shen-min

National pharmaceutical research institute ,Guangxi zhuang autonomous region, Nanning 530001

Objective：To study the effect of total alkaloids of Desmodium pulchellum on the HSC-T6 proliferation and the content of collage andcytokine Method：Culture HSC-T6 cells in vitro,taking the total alkaloids of Desmodium pulchellum (final concentration were 500,250,125,62.5,31.25,15.625 μg/mL)act on the cell of HSC-T6 cell，adopting MTT colorimetric assay for cellsurvival rate after 48 hours and count IC50；The culture supernatant fluid was collected, the contents of COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、COL-Ⅳ、TGF-β1、PDGF were measured by ELISA.Result: The total alkaloids of Desmodium pulchellum could inhibit HSC-T6 cell proliferation,and with the increase in drug concentration,the effect of inhibiting the more significant.The IC50was 337ug/mL；can significantly decrease the level of the contents of COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、PDGF，P<0.05或P<0.01.Conclusion: The total alkaloids of Desmodium pulchellum inhibited the proliferation of HSC-T6 cell and decrease the level of the contents of COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、PDGF.

total alkaloids of Desmodium pulchellum ;HSC-T6;cytokines

1.广西自然科学基金项目：(No.2014GXNSFAA118258)2.广西科学研究与技术开发计划课题(No.桂科能14123006-6)

陈少锋(1970-)，男(汉族)，广西博白人，广西壮族自治区民族医药研究院副主任药师，学士学位，主要从事中药，民族药药理研究工作。

R291.8

A

1006-6810(2017)03-0049-03