重组卡介苗对EB病毒阳性肿瘤的抑制作用研究

薛庆节 李运清 杨春青 杨媛媛 陈廷 李士根

272067 济宁医学院病原生物学教研室(薛庆节、李运清、杨媛媛、陈廷、李士根)； 272067 济宁医学院神经生物学研究所(薛庆节、杨春青)

·论著·

重组卡介苗对EB病毒阳性肿瘤的抑制作用研究

薛庆节 李运清 杨春青 杨媛媛 陈廷 李士根

272067 济宁医学院病原生物学教研室(薛庆节、李运清、杨媛媛、陈廷、李士根)； 272067 济宁医学院神经生物学研究所(薛庆节、杨春青)

目的 研究重组卡介苗(Recombinant BCG, rBCG)对EB病毒阳性肿瘤的抑制作用。方法 建立EB病毒阳性肿瘤(GT39)荷瘤小鼠(C57BL/6)模型，对小鼠存活情况、肿瘤重量、成瘤时间进行分析，流式细胞仪测定CD4+T细胞增殖情况，HE染色法对小鼠肿瘤组织中淋巴细胞浸润情况进行分析；检测rBCG对肿瘤的抑制作用；使用统计学软件SPSS 11.0进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，对rBCG抑制效果进行分析和评价。结果 与对照组相比，rBCG组肿瘤生长明显缓慢，成瘤时间延迟，小鼠生存期明显延长。结论 rBCG在小鼠体内对EB病毒阳性肿瘤细胞具有抑制作用。

Fund programs: National Nature Science Foundation of China(31500056; 81501018); Natural Science Foundation of Shandong Province of China(ZR2015CL021; ZR2012HM037); Science and Technology Plan Project of Jining(2014jnjc08); NSFC Cultivation Project of Jining Medical University(2016)

卡介苗(BCG)注射机体后可诱导细胞免疫及体液免疫的产生，提高机体的免疫力[1]，而机体免疫力的提高，特别是细胞免疫的产生和提高，可以显著增强机体的抗肿瘤能力。许多研究已证明，BCG对膀胱癌、肺癌、皮肤癌、肾癌等有显著预防和治疗作用[2]。在前期工作中，本实验室已成功构建含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulation factor, GM-CSF) 基因及EB病毒表面膜蛋白LMP2A融合蛋白基因GM2A的重组BCG(Recombinant BCG, rBCG)[3]。本研究拟将前期实验中得到的rBCG进行肿瘤抑制研究，评价rBCG对EB病毒阳性肿瘤的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料 GM-CSF及LMP2A一抗为艾博抗(英国)产品,2周龄C57BL/6购自北京华阜康实验动物有限公司；其他细胞及菌株为本实验室构建及保存。

1.2 方法

1.2.1 rBCG分泌性目的蛋白检测：将rBCG、转空质粒BCG(pMV261+ BCG)及BCG株分别接种于M7H9液体培养基中(rBCG需加50 μg/ml Kan+)培养，离心取上清，进行Western blot分析。

1.2.2 抗肿瘤免疫实验：取30只C57BL/6雌性小鼠，将其随机分成5组：PBS组、质粒pMV261-GM2A组、BCG组、转空质粒BCG组(pMV261+ BCG)、rBCG组。小鼠颈背部皮下多点注射。连续3次免疫，每次间隔7 d，第3次免疫后7 d在小鼠后腿左侧按照2×108/只接种EB病毒阳性肿瘤细胞GT39；每3 d测量肿瘤大小，计算肿瘤体积；在肿瘤细胞接种28 d后处死小鼠，剥离肿瘤，洗净血渍，测量并计算其体积与重量。

1.2.3 抑瘤实验：本实验室构建了表达人EB病毒阳性肿瘤细胞GT39的C57BL/6小鼠动物模型[4]，观察测量其成瘤情况，7 d后将形成肿瘤的小鼠随机进行分组，共5组，采用与抗肿瘤免疫实验中相同方法进行免疫，每组小鼠免疫2次，每次免疫注射间隔时间为5 d。

1.2.4 肿瘤生长情况观测：每3 d测量小鼠肿瘤最小半径b和最大直径a。直至将所有小鼠全部处死，完整分离实体瘤，ddH2O洗去血渍及污物并称重。计算其体积(V)，公式为：V=a×b2/2。

1.2.5 流式细胞术检测：抑瘤实验结束后，将其中一只小鼠(取rBCG组肿瘤明显缩小)的肿瘤小心剥下，称量。然后将肿瘤放0.2%蛋白酶中裂解，离心收集裂解细胞，FIFC标记兔抗鼠CD4+抗体(2 mg/ml，博士德生物)150 μl(3 μg/ml)与其混合孵育1 h(温度为4℃)，用流式细胞仪检测CD4+T细胞增殖情况。1.2.6 形态学观察：取抑瘤实验中rBCG组小鼠的肿瘤组织，进行HE染色，观测免疫小鼠肿瘤组织中淋巴细胞浸润情况。

1.3 统计学方法 使用SPSS 11.0统计学软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，对测量数据进行处理与分析，两组之间的比较采Indepent-samples进行t检验，以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot分析 Western blot(图1)结果表明，BCG株、转空质粒BCG株均未出现目的条带，rBCG株分别用GM-CSF及LMP2A一抗杂交后出现目的条带。

1,5: BCG；2: rBCG(GM-CSF蛋白)；3,7： 转空质粒BCG；6： rBCG(LMP2A蛋白)；4,8： 相对分子质量标记(Mr ×103)图1 Western blot检测融合基因的表达1,5: BCG; 2: rBCG(GM-CSF protein); 3,7: BCG with pMV261; 6: rBCG(LMP2A protein); 4,8: Marker(Mr ×103)Fig.1 Detection of the fusion gene expression by Western blot

2.2 rBCG抗小鼠肿瘤的效果 rBCG组肿瘤生长缓慢，与对照组相比，其肿瘤体积差异显著(P=0.028)。rBCG组肿瘤体积最小，其次是BCG组、转空质粒BCG组。BCG 组、质粒pMV261-GM2A组、转空质粒BCG组与PBS组相比体积虽小，但无统计学差异。上述结果表明rBCG应用对EB病毒阳性肿瘤细胞生长具有抑制作用。

2.3 rBCG对小鼠肿瘤的抑制作用 5组小鼠接种EB病毒阳性肿瘤细胞，EB病毒阳性肿瘤抑制实验显示，各组在接种后13 d、28 d，经计算得出rBCG 组肿瘤体积和瘤重与PBS组相比显著减小(P=0.013)，研究表明rBCG对EB病毒阳性肿瘤细胞抑制作用显著，BCG 组、转空质粒BCG组对肿瘤细胞早期有抑制作用，晚期不明显。

A：BCG；B：转空质粒BCG；C：rBCG图2 rBCG组淋巴细胞浸润情况A:BCG; B:BCG with pMV261; C:rBCGFig.2 Infiltration of lymphocytes in rBCG group

2.4 rBCG对CD4+T细胞增殖情况分析 经流式细胞术分析，rBCG刺激下CD4+T的增殖能力明显高于对照各组，差异达显著水平(P=0.039)，转空质粒BCG组CD4+T细胞增殖也高于其他各组，其原因有待于进一步研究。

2.5 肿瘤组织淋巴细胞形态学观察 对BCG、转空质粒BCG、rBCG组免疫小鼠肿瘤组织的HE染色后进行观察，发现rBCG组小鼠肿瘤局部有明显淋巴细胞浸润，对照BCG、转空质粒BCG作用不明显，进一步说明rBCG对肿瘤细胞有明显的作用效果。如图2箭头所示。

3 讨论

研究表明rBCG能够引发较强的细胞免疫，LMP2A及GM-CSF可刺激C57BL/6小鼠机体产生特异性抗体，流式细胞术检测到rBCG能够诱导EB病毒阳性肿瘤细胞凋亡[5,6]。其有关机制可能是：GM-CSF对树突状细胞(Dendritic cell, DC)具有调节作用，这种调节作用可以促进DC增殖分化并维持其活力，其抗肿瘤及调节作用的研究早已受到人们的重视[5]。EB病毒表面蛋白LMP2A在被感染的B淋巴细胞膜表面存在，可以作为抗原，刺激动物机体产生抗体，还可以引发机体产生大量特异性CTL反应[7]。

本研究结果表明，BCG及转空质粒BCG组对EB病毒阳性肿瘤细胞早期均有抑制作用，这可能与BCG本身能够激活机体的细胞免疫，在一定程度上杀伤肿瘤细胞有关[8]。在肿瘤生长后期只有rBCG组对肿瘤细胞有明显的抑制作用。BCG及转空质粒BCG组在肿瘤早期能通过非特异性免疫应答抑制肿瘤细胞的分裂及生长，但不能诱导特异性免疫应答的产生，对肿瘤后期作用效果不明显。rBCG对EB病毒阳性肿瘤抑制效果优于BCG和转空质粒BCG组，这说明rBCG能够诱导针对EB病毒阳性肿瘤细胞的特异性免疫应答；流式细胞术检测显示在rBCG刺激下CD4+T的增殖能力明显高于对照各组。rBCG组小鼠肿瘤组织中有明显淋巴细胞浸润，虽然两对照也有一定的淋巴细胞浸润，但不明显，这可能与BCG本身就可刺激机体产生免疫反应，具有一定的抗肿瘤作用有关。

[1] Arania C, Waseem S, Fernandez C, et al. A recombinant Bacille Calmette-Guerin construct expressing the plasmodium falciparum circumsporozoite protein enhances dendritic cell activation and primes for circumsporozoite-specific memory cells in BALB/c mice[J]. Vaccine, 2012, 30(37):5578-5584. doi:10.1016/j.vaccine.2011.09.054.

[2] Young S, O′Donnell M, Lockhart E. Manipulation of immune reponses to Mycobacterium bovis by vaccination with IL-22 and IL-18 secreting recombinant bacillus Calmette Guerin[J]. Immunol Cell Biol, 2002, 80:209-215. doi:10.1046/j.1440-1711.2002.01078.x.

[3] 薛庆节, 李秀真, 陈廷. 人GM-CSF与EB病毒LMP2A融合基因的构建与鉴定[J].中国病原生物学杂志, 2012, 7(11):820-822. doi:10.13350/j.cjpb.2012.11.003.

[4] Xue QJ, Dai J, Li XZ, et al. Construction of a recombinant-BCG containing the LMP2A and BZLF1 genes and its significance in the Epstein-Barr virus positive gastric carcinoma[J]. J Med Virol, 2014, 86(10):1780-1787. doi: 10.1002/jmv.23901.

[5] Cui H, Chang XH, Liu B, et al. The antitumor immune responses induced by a fusion protein of ovarian carcinoma anti idiotypic antibody 6BllScFv and murine GM-CSF in BALB/c mice[J]. Gynecol Cancer, 2004, 14(2):234-241. doi:10.1111/j.1048-891X.2004.014206.x.

[6] 陈廷, 王晖, 吕厚东, 等. GM-CSF与LMP2A融合基因重组卡介苗的免疫学特性[J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 2014, 34(7):509-512. doi:10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2014.07.004.

[7] O′Donnell MA, Aldovini A, Duba R. Recombinant mycobac-terium bovis BCG secreting functional interleukin-2 enhances gamma interferon production by splenocytes[J]. Infect Immun, 1994, 62:2508-2514. doi:10.1007/s10555-009-9195-6.

[8] Rosevear HM, Lightfoot AJ, O′Donnell MA. The role of neutrophils and TNF-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL) in bacillus Calmette-Guerin(BCG) immunotherapy for urothelial carcinoma of the bladder[J]. Cancer Metastasis Rev, 2009, 28(3/4):345-353. doi:10.1007/s10555-009-9195-6.

(本文编辑：吕新军)

The research of rBCG inhibiting function on EB virus positive tumors

XueQingjie,LiYunqin,YangChunqing,YangYuanyuan,ChenTing,LiShigen

DepartmentofPathogenicBiology,JiningMedialUniversity,Jining272067,China(XueQJ,LiYQ,YangYY,ChenT,LiSG);InstituteofNeuroscience,JiningMedialUniversity,Jining272067,China(XueQJ,YangCQ)

XueQingjie,Email:qjxue9797@126.com

Objective The inhibition function on EB virus positive tumors with rBCG (recombinant BCG) was researched. Methods After cancer models of EB virus positive tumor cells(GT39)were established in C57BL/6 mice, the mice survival conditions, tumor weight and tumor formation time were analyzed, flow cytometry was used to research the proliferation of CD4+T. Inhibition of rBCG to cancer was researched, HE staining of the mice tumor tissue was used to detect and analyze lymphocyte infiltration. Single factor analysis method of variance (One-way ANOVA) was processed for rBCG′s inhibition evaluation by SPSS 11.0 statistical software. Results Compared with the control group, rBCG group significantly slowed tumor growth, tumor formation time was delayed, rBCG significantly prolonged survival time of the mice. Conclusions rBCG had inhibition to EB virus positive tumors in mice.

rBCG; Anti-tumor; EB virus

薛庆节，Email: qjxue9797@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.02.001

国家自然科学基金(31500056；81501018)；山东省自然科学基金(ZR2015CL021；ZR2012HM037)；济宁市科技计划项目(2014jnjc08)；济宁医学院国家自然科学基金培育项目(2016)

重组卡介苗；抗肿瘤；EB病毒

2016-10-13)