光照强度对狼爪瓦松愈伤组织有效物质积累的影响

李金蓉, 廉美兰, 于 垚， 刘冠甫， 蒋晓龙， 朴炫春

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

光照强度对狼爪瓦松愈伤组织有效物质积累的影响

李金蓉, 廉美兰, 于 垚， 刘冠甫， 蒋晓龙， 朴炫春*

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

以狼爪瓦松种子诱导的愈伤组织为材料，研究了光照强度对愈伤组织生物量及黄酮积累的影响。结果表明:光照强度为15～30 (mol·cm-2·s-1)时，有利于狼爪瓦松愈伤组织鲜重和干重的增加；对于狼爪瓦松中酚的积累，光照强度为15 (mol·cm-2·s-1)时，其含量(17.4 mg/g DW)及生产量(68.53 mg/L)最高。而当光照强度达到30 (mol·cm-2·s-1)时，可得到最高的多糖含量(125.8 mg/g DW)和生产量(615.05 mg/L)。对于黄酮类物质，光照强度为15 (mol·cm-2·s-1)时，最有利于山奈酚-3-O-芸香糖苷的积累，而槲皮素、山奈素、表儿茶素没食子酸酯和异槲皮苷的积累在光照强度为30 (mol·cm-2·s-1)时最佳；总黄酮的含量(3 816.6 mg/g DW)和生产量(18 654.0 mg/L)在光照强度30 (mol·cm-2·s-1)时达到最大值。因此，光照强度是狼爪瓦松愈伤组织有效物质积累和生物量增加的影响因素之一，在愈伤组织培养时将光照强度调节为30 (mol·cm-2·s-1)较为适宜。

光照强度；愈伤组织；多糖；酚；黄酮

狼爪瓦松(Orostachyscartilagineus)为景天科瓦松属2年生草本药用植物[1-4]。多生于山坡岩石上，主要产于山东、内蒙古、辽宁、吉林和黑龙江等地区。狼爪瓦松全株可药用，具有抗病毒、抗菌[5-7]等作用，其化学成分十分复杂，主要成分有黄酮类、糖类、多酚等。

黄酮类物质是植物的重要次生代谢产物，是具有开发前景的天然抗氧化剂，能有效地减少和清除自由基，具有延缓人体衰老、防治疾病的作用[8]。随着食品工业的发展与消费观念的改变，具有天然活性成分的保健食品成为现代人追逐的目标，其中黄酮类化合物以纯天然、高活性、见效快、作用广泛等特点受到人们的关注[9]。目前，因过度采摘，狼爪瓦松野生资源逐渐减少，且人工栽培体系尚不完善，因此，其资源利用和开发受到限制[10]。

利用植物细胞培养工程手段，通过培养细胞、组织和器官的方式生产有效代谢产物逐渐引起人们的关注，这种方式可做为获取原材料的另一途径[11]。生物反器不受季节性或区域性的限制，为植物生长和代谢提供完整的理化指标，为植物提供最佳的生长环境。具主要应用于代谢产物生产、生物转化、快速繁殖和人工种子等方面。它可实现大量生产植物细胞、组织和器官的目的[12]。影响生物反应器培养的因素有很多，其中光照条件是重要因素之一。不同植物种类、外植体在不同光照强度下的合成代谢物水平不同[13]，为了高效培养目的产物，确定适宜光照强度是培养过程中的一个重要环节。因此，该试验研究了光照强度对生物反应器培养的狼爪瓦松愈伤组织生长和多糖、酚及黄酮(槲皮素、山奈素、表儿茶素没食子酸酯、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷)积累的影响，旨在筛选愈伤组织培养的适宜光照强度，为狼爪瓦松产品生产提供一种新的原材料打下理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

狼爪瓦松种子采于吉林省龙井市延边农业科学院植物园。将种子无菌播种在1/2 MS+7.8 g/L琼脂的培养基(pH值5.8)。待无菌播种的试管苗叶片长出后，将叶片边缘切除之后接种到MS+3.5 mg/L BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+7.8 g 琼脂培养基(pH值5.8)中诱导愈伤组织。约30 d后，将诱导出的愈伤组织在MS+3.5 mg/L BA+0.1 NAA +30 g 蔗糖+7.8 g 琼脂培养基(pH值5.8)培养中进行增殖培养，在温度(25±2) ℃，光照强度30 (mol·cm-2·s-1)，每天光照6 h的条件下培养。每隔20 d继代1次。

1.2 试验方法

将继代培养20 d的新鲜愈伤组织切成0.5 cm×0.5 cm 左右，称取约20 g(鲜物重)并接种于3 L球型气升式反应器中，每个反应器中加入2 L培养基(MS+3.5 mg/L BA+0.1 NAA+30 g 蔗糖，pH值5.8)。每个反应器的通气量设为100 mL/min，培养温度为(25±2) ℃。为探明光照强度的影响，将反应器分别置于每天光照16 h的15，30，45 (mol·cm-2·s-1)光照强度下和黑暗条件下。培养25 d后收获，测定愈伤组织生物量(鲜重和干重)、总多糖和酚及5种黄酮(槲皮素、山奈素、表儿茶素没食子酸酯、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷)的含量，并计算生产量。物质生产量/(mg/L)=含量/(mg/g DW)×愈伤组织干重/(g/L)

1.3 测定方法

1.3.1 生物量的测定

第三册AWL覆盖率为3.67%，偏向于通用英语。由图3可知，第三册各文本AWL覆盖率在范围1.2%-7.66%之间波动，每单元两篇文章AWL覆盖率相差较大，衔接较差。

将收获的愈伤组织置于筛网内，用自来水冲洗干净，装入干净的布袋中，利用脱水机(1 000 r/min，SS751-1 000，泰州市通洋洗涤机械制造有限公司，中国)脱水5 min, 称取其鲜物重。然后将所有的愈伤组织放于45 ℃的烘干箱(YAD1205，杭州市利迪试验仪器有限公司，中国)中，烘干48 h后取出称其干物重。

1.3.2 多糖的测定

改良Lemmon等[14]的方法提取多糖。精密称取愈伤组织粉末0.1 g，用90%乙醇浸泡2次，每次6 h，待挥干乙醇后，加入50 mL的蒸馏水，45 ℃条件下超声提取30 min。滤纸过滤后，收集提取液，滤渣再次加入50 mL的蒸馏水，重复超声提取3次。将所有提取液合并，在5 000 r/min条件下，离心15 min，并取上清液。随后浓缩干燥上清液，再用Sevage试剂除蛋白3次。加入适量的95%的乙醇，静止12 h以利于多糖的沉淀。随后抽滤，滤渣分别用无水乙醇、丙酮和乙醚清洗3次后放在45 ℃烘干箱中烘干，得到多糖。用蒸馏水定容至1 mL后，添加1 mL 5%的苯酚和5 mL浓硫酸，静置30 min后，利用分光光度计(UV110，上海天美科学仪器有限公司)于波长490 nm处，测定其OD值。

1.3.3 酚含量的测定

改良Hossain等[15]方法，测定酚的含量。精密称取干样品0.1 g，分别置于50 mL的三角瓶中，加入20 mL 80%的甲醇溶液后在80 ℃水浴1 h，冷却后，在4 ℃条件下离心15 min (5 000 r/min)。取上清液定容到25 mL，从中吸取1 mL稀释至一定体积，在760 nm处测其OD值。

1.3.4 黄酮类物质的测定

取1 g愈伤组织粉末，置于250 mL蒸馏烧瓶中，并加入50 mL含5%盐酸的80%甲醇溶液，80 ℃回流提取1 h。滤液在60 ℃下减压浓缩至1 mL左右液体，加入双重蒸馏水定容到25 mL。并用25 mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用15 mL蒸馏水清洗分液漏斗后，将清洗液与乙酸乙酯提取液合并，60 ℃下减压挥干，甲醇定容至5 mL后，用0.45 μm有机滤器过滤，既得待测样品。利用C18色谱柱(250×4.6 mm，5 μm，Theromo scientific，美国)的高效液相色谱(LC-15C，津岛公司，日本)测定5种单体黄酮类化合物(图1)含量。高效液相色谱法( HPLC) 于 1960年后期开始应用，是色谱法的一个重要分支，据估计，自然界70%以上的化合物均可用这种方法分析[16]。其中，槲皮素(Qc)和山萘素(Ke)(标准品购自成都曼斯特生物科技有限公司)在366 nm波长下检测(图2A和图2B)，进样量为10 μL，流动相为甲醇与0.1%磷酸水溶液，流速为0.8 mL/min，柱温30 ℃。表儿茶素没食子酸酯(Ecg)、异槲皮苷及(Qc-3-glc)山奈酚-3-O-芸香糖苷(Kp-3-rut)(标准品均购自成都曼斯特生物科技有限公司)在280 nm波长下检测(图2C和图2D)，其他色谱条件同上。黄酮总含量和生产量为5种单体黄酮之和。

图1 狼爪瓦松愈伤组织中5种单体黄酮类化合物结构式

1，Qc; 2, Ke; peak 3, Ecg; peak 4, Qc-3-glc; peak 5, Kp-3-rut

2 结果与分析

通过对狼爪瓦松愈伤组织鲜重和干重的测定，发现光照条件对愈伤组织生物量有较大影响。与黑暗条件相比，光照有利于狼爪瓦松愈伤组织生物量积累，光照强度从15 (mol·cm-2·s-1)增大到30 (mol·cm-2·s-1)时，干物重和鲜物重显著增大，光照强度为30 (mol·cm-2·s-1)时鲜物重(154.2 g/L)和干物重(4.9 g/L)达最大值；但光照强度继续增大至45 (mol·cm-2·s-1)时，鲜物重和干物重则呈下降趋势(表1)。

光照条件对愈伤组织中有效物质积累也有明显的作用。与光照条件对生物量积累的影响相似，与暗培养比较，在光照条件下多糖和酚积累明显增加。随光照强度不断增大，多糖含量和生产量也随之增大，当光照强度达到30 (mol·cm-2·s-1)时，多糖含量和生产量达最大值，分别为125.8 (mg/g DW)和615.0 mg/L，随后光照强度继续增大多糖含量和生产量下降(图3，图中字母表示在0.05水平上差异显著)。愈伤组织中酚积累与多糖有些差异，在15 (mol·cm-2·s-1)光照强度时最高，含量为17.4 mg/g DW，生产量达到74.6 mg/L。

表1 光照强度对反应器培养狼爪瓦松愈伤组织生物量积累的影响

注：字母表示在0.05水平上差异显著。

图3 光照强度对反应器培养狼爪瓦松愈伤组织有效物质积累的影响

2.2 光照强度对反应器培养狼爪瓦松愈伤组织黄酮积累的影响

由图4可知，狼爪瓦松愈伤组织中5种单体黄酮的积累在光照条件下明显高于黑暗条件，不同单体黄酮对最适光照强度的要求有差异。对于Qc和Qc-3-glc，在光照强度为15～30 (mol·cm-2·s-1)时，达到最大值，分别为271.3和280.5 (μg/g DW)。Ke和Ecg的含量随光照强度的增强而增加，在光照强度为30 (mol·cm-2·s-1)时，达到最大值,分别为699.2和761.6 (μg/g DW)；光照强度增加至45 (mol·cm-2·s-1)时，Ke和Ecg含量下降。单体黄酮Kp-3-rup含量在光照强度为15 (mol·cm-2·s-1)时达最大,为2 031.3 (mg/g DW)，光照强度继续增大时则下降。5种黄酮单体生产量变化趋势相似，在光照强度达30 (mol·cm-2·s-1)时均达到最大值。

总黄酮含量和生产量在光照处理时高于黑暗处理。光照强度为15～30 (mol·cm-2·s-1)时，狼爪瓦松中总黄酮含量最大，达3.8 (mg/g DW)；而总黄酮生产量在光照强度为30 (mol·cm-2·s-1)时，达最大，为18.7 mg/L，光照强度继续增加，总黄酮含量与生产量均下降(图5,图中字母表示在0.05水平上差异显著)。

图4 光照强度对反应器培养狼爪瓦松愈伤组织5种单体黄酮类物质积累的影响

图5 光照强度对反应器培养狼爪瓦松愈伤组织单体黄酮类物质总量的影响

3 讨论与结论

光照条件以及适当光照强度影响代谢物在植物组织中的含量和分布。王华田等[17]报道，光照强度为42%自然光强时，银杏叶黄酮含量最高，高于或低于这一光强时含量均降低。Agati Giovanni等[18]采用微量荧光标记法和荧光微缩图像技术对阔叶欧洲女贞(PhillyrealatifoliaL.)的叶片进行研究，发现完全暴露在光下的叶片从表皮区到内层海绵组织都有黄酮类成分的积累，而给予15%遮阴条件的叶片只在表皮区有此成分的积累。我国学者研究发现适当延长光照时间也可以增加黄酮类物质的含量。李卫东等[19]报道大豆出苗期间大豆异黄酮含量随日照时数增加而增加。汪海峰等[20]对不同海拔地区的银杏叶黄酮昔含量进行调查时发现，高海拔地区较长的日照时间是促进银杏叶黄酮积累的一个重要因素。

植物组织培养中，光照对愈伤组织的培养也有显著的影响。光照条件下，荞麦愈伤组织由于光合作用产生叶绿素而呈绿色，且合成较多的黄酮，这可能与光照条件下的细胞中叶绿体的分化有关[21]。研究表明，细胞中有叶绿体分化时，黄酮含量明显提高[22]。另外，刘蓉等[23]研究表明，光照强度是影响葡萄愈伤组织诱导和继代培养的重要外界环境因子，较高的光照强度会导致愈伤组织诱导率下降及褐化率增加，而光照强度较低会影响愈伤组织生长。该试验结果发现,光照强度对狼爪瓦松愈伤组织生物量及有效物质积累有很大影响，当光照强度为30 (mol·cm-2·s-1)时，愈伤组织中多糖、酚和黄酮含量及生产量最多，但光照强度低于或高于30 (mol·cm-2·s-1)时，不利于有效物质积累。因此，适宜的光照强度可提高狼爪瓦松愈伤组织生物量和有效物质积累，30 (mol·cm-2·s-1)是培养的最佳光照强度。

[1] 韩荣娜.景天科3种植物繁殖技术研究[D].哈尔滨:东北林业大学,2012.

[2] 郑万金,张萍,仲英.瓦松属植物的研究进展[J].齐鲁药事,2008,27(03):161-163.

[3] 郑艳.安徽景天科野生资源及开发展望[J].安徽师大学报 (自然科学版),1998,21(04):73-76.

[4] 金英花,朴哲龙.吉林省龙井地区瓦松属植物种群生态特性[J].延边大学农学学报,2014,36(04):306-310..

[5] 王亚红,王亚丽,杨艳俊.大孔树脂纯化瓦松中总黄酮的工艺[J].中国医院药学杂志,2014,34(10):791-794.

[6] 丁芬,王亚茹.狼爪瓦松粗提物抑菌效果研究[J].黑龙江医药,2013,26(02):227-228.

[7] 任荣,柴军红,金志民,等.狼爪瓦松全草粗提物体外抑菌作用研究[J].安徽农业科学,2011,39(14):8353-8354.

[8] 乌兰格日乐,白海泉,翁惠.黄酮的抗氧化活性活性研究进展[J].内蒙古民族大学学报(自然科学版),2008,23(03):276-280.

[9] 王长远,吴洪奎,于长青,等.黄酮类化合物研究进展[J].黑龙江八一农垦大学学报,2007,19(02),75-78.

[10] 刘颖,李东杰,魏景芳.药用植物细胞生物反应器技术的研究进展[J].中国生物工程杂志,2005,50(18):67-70.

[11] 许明子,李美善.高山红景天愈伤组织诱导及生长研究[J].延边大学农学学报,2003,25(04):1-3.

[12] 邵春绘,廉美兰,李铁军,等.几种因素对高山红景天愈伤组织诱导和增殖的影响[J].延边大学农学学报,2013,35(04):289-292.

[][]

[13] Ouyang J,Wang X,Zhao B,et al.Light intensity and spectral quality influencing the callus growth ofCistanchedeserticolaand biosynthesis of phenylethanoid glycosides[J].Plant Science,2003,165(03):657-661.

[14] Lemmon H R,Sham J,Chau L A,et al.High molecular weight polysaccharides are key immunomodulators in North American ginseng extracts:characterization of the ginseng genetic signature in primary human immune cells[J].Journal of Ethnopharmacology,2012,142(01):1-13.

[15] Hossain M A,Shah M D,Sang S V,et al.Chemical composition and antibacterial properties of the essential oils and crude extracts ofMerrrmiaborneensis[J].Journal of King Saud University-Science,2012,24(07):243-249.

[16] 于帅,杜彬,杨越冬,等.植物中多酚的研究进展[J].河北科技师范学院学报,2011,25(03),68-73.

[17] 王华田,谢宝东,姜岳忠,等.光照强度对银杏叶片发育及黄酮和内脂含量的形响[J].江西农业大学学报,2002,24(05):618- 622.

[18] Agati G,Galardi C,Gravano E, et al. Flavonoid distribution in tissues ofPhillyrealatifoliaL.Leaves as estimated by microspetrofluorometry and multispectral fluorescence microimaging[J].Photochemistry and Photobiology,2002,76(03): 350-360.

[19] 李卫东,粱慈珍,卢为国,等.大豆籽拉异黄酮含量与生态因子相关系的研究[J].中国农业科学,2004,37(10):1458-1463..

[20] 汪海峰,钧兴荣,何广斌,等.不同海拔高度和生长季节对银杏叶中黄酮含量的形响[J].林产化学与工业,2002,22(04):47-50.

[21] 王鹏姬,冯佰利.荞麦愈伤组织培养及其黄酮和成研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2013.

[22] 秦公伟,曹小勇,张静,等.银杏叶片愈伤组织培养及光暗条件对黄酮含量的影响[J].陕西理工学院学报(自然科学版),2011,27(01):71-76.

[23] 刘蓉,杨国伟,吴月燕,等.光照强度对葡萄愈伤组织形成过程中相关酶活性和基因表达的影响[J].生物工程学报,2015,31(08):1219-1229.

The effects of light intensity on callus biomass and effective compound accumulation ofOrostachyscartilagineaV. N. Boriss

LI Jinrong， LIAN Meilan， YU Yao， LIU Guanfu， JIANG Xiaolong， PIAO Xuanchun*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

In this study, the calluses induced fromO.cartilagineusseeds were used as the experimental material to investigate the effects of light intensity on callus biomass and effective compound accumulation. The results showed that the light intensity from 15 to 30mol·cm-2·s-1was beneficial to callus biomass accumulation, the fresh and dry weight reached the maximum level. For effective compound accumulation, the highest total phenolic content (17.4 mg/g DW) and productivity (68.53 mg/L) were found under 15mol·cm-2·s-1of light intensity, but the maximum polysaccharide content (125.8 mg/g DW) and productivity (615.05 mg/L) were obtained under 30mol·cm-2·s-1of light intensity. In addition, light intensity also affected flavonoid accumulation, 15mol·cm-2·s-1of light intensity was the most favorable for kaempferol-3-O-rutinoside accumulation, but the quercetin, kaempferol, epicatechin gallate, and isoquercitrin enhanced under 30mol·cm-2·s-1of light intensity. The total flavonoid content (3 816.6 mg/g DW) and productivity (18 654.0 mg/L) also reached the maximum under 30mol·cm-2·s-1light intensity. Therefore, the light intensity is one of important factors inO.cartilaginouscallus culture for production of effective compounds and 30mol·cm-2·s-1is the suitable light intensity.

light intensity; callus;polysaccharides;phenol;flavonoid

2017-03-06 基金项目：国家自然科学基金委项目(31260182)

李金蓉(1993—)，女，吉林长春人，在读硕士，研究方向为植物组织培养及生物反应器的应用。朴炫春为通信作者，E-mail:mllian@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)01-0035-07

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.01.006

S567.239

A