猪源性大肠杆菌分离鉴定及体外抑菌试验

张 瑜， 李金霞， 徐 璐， 刘馨宇， 王 莹， 张雪梅

(延边大学农学院动物医学系，吉林 延吉 133002)

猪源性大肠杆菌分离鉴定及体外抑菌试验

张 瑜， 李金霞， 徐 璐， 刘馨宇， 王 莹， 张雪梅*

(延边大学农学院动物医学系，吉林 延吉 133002)

试验从延边地区养猪场临诊上疑似大肠杆菌病的仔猪中无菌采集粪便和血样52份，进行大肠杆菌分离鉴定及致病性研究；通过纸片扩散法测定四环素、磺胺嘧啶钠及链霉素对分离株及标准菌株的抑菌效果，通过试管二倍稀释法及牛津杯法测定中药蒲公英、连翘及柴胡粗提物对分离株及标准菌株的最小抑菌浓度(MIC)及抑菌效果。结果表明：共分离鉴定28株大肠杆菌，分离率54%；79%分离株可致死小鼠；大肠杆菌对四环素及磺胺嘧啶钠敏感度较低，耐药率分别为89%和64%，对链霉素敏感度较高，耐药率为6%；蒲公英粗提物的MIC值为0.05 g/mL，连翘与柴胡粗提物的MIC值均为0.1 g/mL，3种中药粗提物均可抑制大肠杆菌生长，且蒲公英粗提物的抑菌效果最强。该试验结果表明:分离株对抗菌药的耐药性明显，中药体外抑菌效果明显,为延边地区仔猪腹泻性大肠杆菌病的防治及新药的开发提供依据。

仔猪；大肠杆菌；分离鉴定；最小抑菌浓度；抑菌效果

大肠埃希氏菌，俗称大肠杆菌，是肠道常见细菌。大肠杆菌的O血清群通常与致病菌株不相关、不具有共同的特征毒力因子，仅某些特殊血清型具有致病性[1]。该菌可以引起不同动物腹泻、肠炎、甚至脱水而死，也可以引起其他器官感染[2]。在养猪业中，致病性大肠杆菌是引起新生仔猪黄痢、白痢、断奶仔猪腹泻和水肿病等的重要病原之一，其流行性广，发病率、死亡率高，严重制约着养猪业的发展。由于畜禽养殖业对抗生素的过度依赖,造成动物源大肠杆菌耐药株不断增多,耐药机制日趋复杂,致使细菌耐药性问题日趋严重[3]。目前，大肠杆菌超级菌株、食品中毒、广谱耐药等问题已经成为全球关注的热点，监测动物源大肠杆菌耐药性具有重要的公共卫生意义[4]。

中药在我国有上千年的历史，被认为是天然成分的有效来源，有非常好的利用价值和发展前景[5]。该试验通过对延边地区部分养猪场腹泻仔猪进行大肠杆菌分离鉴定及致病性研究,抗菌药耐药性分析，中药抑菌效果测定，筛选出抑菌效果较好的中药，对延边养猪地区仔猪腹泻性大肠杆菌病的防治及中药的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

从延边地区部分养猪场，无菌采集1～2月龄仔猪直肠粪便及耳静脉血共52份[6]。大肠杆菌标准菌株ATCC25922 (Escherichiacoli)由延边大学农学院微生物实验室提供。

1.1.2 培养基及试剂

LB肉汤、NB肉汤、伊红美兰琼脂、尿素琼脂、西蒙氏枸橼酸盐琼脂、三糖铁琼脂、琼脂粉等(青岛海博微生物试剂有限公司)；Kovacs试剂、蛋白胨水、磷酸盐葡萄糖胨水、VP试剂、甲基红试剂、乳糖、甘露醇等生化鉴定管(杭州滨和微生物试剂有限公司)。

1.1.3 药品及制备

磺胺嘧啶钠药敏纸片(北京天坛药物生物技术开发公司)，四环素、链霉素药敏纸片(杭州滨和微生物试剂有限公司)；蒲公英、柴胡、连翘(延吉市海兰江药房)。称取中药干草各300 g，分别蒸馏水浸泡过夜，水煎3次，合并滤液浓缩至1 g/mL[7]。

1.1.4 试验动物

ICR小鼠，体重(20±2) g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 大肠杆菌分离纯化

将采集样品LB肉汤增菌 37 ℃培养16～18 h，取0.2 mL菌液均匀涂布于伊红美兰琼脂平板，37 ℃培养18～24 h，挑取单个带有金属光泽的黑色可疑菌落划线于伊红美蓝平板，37 ℃培养18～24 h，重复2～3次，挑取单个带有金属光泽的黑色可疑菌落划线于LB平板，37 ℃培养18～24 h，重复2～3次，挑取单个光滑圆形白色可疑菌落划线于LB斜面37 ℃培养16～18 h，4 ℃保存备用。

1.2.2 革兰氏染色

挑取单个典型菌落于载玻片，与PBS缓冲液均匀混合，涂成薄层。涂片后室温干燥、染色，置油镜观察。

1.2.3 生化鉴定

将分离株分别接种于三糖铁、尿素及西蒙氏枸橼酸盐琼脂，37 ℃培养18～24 h，观察斜面颜色变化及产气情况；对分离株的生化指标进行测定，记录结果。

1.2.4 致死性试验

将比浊度达9×108CFU/mL菌液对小鼠进行腹腔注射，0.6 mL/只，对照组注射等体积LB肉汤，接种后饲养72 h。结果判定标准：4 h内死亡为高毒力菌株，4～12 h为中毒力菌株，12～24 h为低毒力菌株，不致死为无毒菌株[8]。观察并记录结果。

1.2.5 抗菌药药敏试验

采用纸片扩散法，无菌条件下，取菌液0.2 mL均匀涂布于LB琼脂平板，将四环素、磺胺嘧啶钠及链霉素药敏纸片按一定密度均匀贴于琼脂表面，37 ℃培养18～24 h，测量抑菌圈大小[9]。

1.2.6 中药粗提物最小抑菌浓度(MIC)测定

采用试管二倍稀释法，每组1号试管中加各中药粗提物1 mL与9 mL LB液体培养基混匀，2号试管取1号试管培养液5 mL与5 mL LB液体培养基混匀，以此类推至5号管，第6号管为生长对照管，每管加0.2 mL菌液，37 ℃培养18～24 h，测MIC值[10]。

1.2.7 中药粗提物药敏试验

采用牛津杯法，将各中药粗提物稀释成1、0.5、0.25、0.125、0.0 625 g/mL共5个浓度。吸取灭菌LB琼脂培养基15 mL倒入平皿内凝固备用,吸取比浊度达9×108CFU/mL的大肠杆菌菌液0.2 mL与50 mL冷却至50 ℃的LB琼脂均匀混合，每个平皿内加5 mL，均匀摊布。每个平皿中均匀放置灭菌牛津杯3个，每个牛津杯加0.2 mL药液，置37 ℃培养16～24 h，测量抑菌圈大小。

2 结果与分析

2.1 分离纯化及鉴定结果

共分离出28株可疑菌株，均符合大肠杆菌生化特性，其中,肠源26株，血源2株(表1)。

表1 大肠杆菌生化鉴定结果

2.2 革兰氏染色结果

分离株均为革兰氏阴性菌，菌体呈红色短杆状，成对或单个存在，符合大肠杆菌的形态特性(图1)。

图1 革兰氏染色结果(1000×)

2.3 致死性试验结果

由表2可知，79%的分离株可致死小鼠，对小鼠有不同程度的毒力；21%分离株可致小鼠腹泻，但毒力小，可自愈，无致死性。

表2 致死性试验结果

2.4 抗菌药药敏试验结果

选用四环素、磺胺嘧啶钠及链霉素，通过纸片扩散法对分离株及标准菌株进行药敏试验及耐药性分析。由表3可以看出,分离株对四环素、磺胺嘧啶钠耐药率分别为89%和64%，对链霉素敏感度较高，耐药率为6%，判定标准参照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)方法手册(2004年版)规定标准[11]。

表3 抗菌药药敏试验结果(抑菌圈直径：mm)

注：“—”为无抑菌圈,下同。

2.5 中药最小抑菌浓度(MIC)测定结果

选用蒲公英、柴胡及连翘粗提物，通过试管二倍稀释法测定其MIC值。由表4可知，在试验浓度范围内，蒲公英的MIC值为0.05 g/mL，连翘与柴胡的MIC值均为0.1 g/mL。

表4 中药MIC值测定结果

注：“+”为不能抑制大肠杆菌生长，“—”为抑制大肠杆菌生长。

2.6 中药药敏试验结果

选用蒲公英、柴胡及连翘粗提物，通过牛津杯法对分离株及标准菌株进行药敏试验。由表5、6、7可知，蒲公英、连翘及柴胡对大肠杆菌均有抑制作用，各中药的抑菌效果均表现出剂量依赖关系。其中,1 g/mL蒲公英粗提物的抑菌效果最强，32%分离株呈高度敏感，68%分离株呈中度敏感；连翘及柴胡抑菌效果次之，68%分离株对1 g/mL连翘粗提物呈中度敏感，32%呈轻度敏感；36%分离株对1 g/mL柴胡粗提物呈中度敏感，64%分离株呈轻度敏感(判定标准：抑菌圏直径小于7.5 mm为耐药；抑菌图直径在7.5～10 mm为轻度敏感，抑菌圏直径在10～14 mm为中度敏感：抑菌圏直径在15～20 mm为高度感；抑菌圏直径大于20 mm为极度敏感)[12]。

表5 蒲公英牛津杯试验结果(抑菌圈直径：mm)

续表5 蒲公英牛津杯试验结果(抑菌圈直径：mm)

表6 连翘牛津杯试验结果(抑菌圈直径：mm)

表7 柴胡牛津杯试验结果(抑菌圈直径：mm)

3 讨论与结论

大肠杆菌多为肠道正常菌群，在伊红美兰培养基上生长为黑色带有金属光泽，表面光滑，边缘整齐的圆形菌落。纯培养物革兰氏染色镜检，两端钝圆，呈单个或成对分布的短杆状。吲哚及MR试验呈阳性，VP试验呈阴性，可分解乳糖、甘露醇、山梨醇产酸产气，不分解尿素，不利用枸橼酸盐，不产生硫化氢。大肠杆菌的特殊血清型具有致病性，本试验中52份样品中分离出28株猪源性大肠杆菌，毒力强，79%具有致病性[13]。

近年来，用于防治仔猪大肠杆菌病的药物多为抗菌药，在使用过程中不仅杀灭了致病菌，也破坏了原有的正常菌群，增加机体对外源感染的敏感性，且长期使用造成了药物残留及耐药性的产生[14]。本试验分离的大肠杆菌对四环素及磺胺嘧啶钠耐药率分别为89%和64%，对链霉素敏感，耐药率为6%，这与临床用药密切相关，说明抗生素的长期使用导致耐药菌株的增多。因此，为了避免新耐药菌株的产生，研制抗生素替代产品已成为必然。

中国是一个有着三千年历史的文明古国，各民族经过长期实践创造了中国灿烂的文化，中药学就是其中一部分[15]。中药以资源丰富、价格低廉、毒副作用小、无残留，不易产生耐药性而成为研究热点，用中药来防治动物疾病的研究越来越受到人们的重视[16]。柴胡作为传统中药，具有较好的抗菌抗病毒的作用，且随着剂量加大抗菌抗病毒能力有一定程度的提高[17]。连翘具有广谱抗菌作用，其中有效成分连翘酯苷具有极强的抗菌抗病毒活性，对多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均有抑制作用[18]。蒲公英为菊科多年生草本植物,具有抗病原微生物,提高免疫功能等功效，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等均有较好的抑制作用, 有“天然抗生素”之美称，临床上现已用蒲公英制成了注射剂、片剂、糖浆、粉剂等不同剂型,广泛应用于临床多种感染性炎症[19]。本试验选用蒲公英、连翘及柴胡，通过试管二倍稀释法及牛津杯法，对分离株的MIC值及体外抑菌效果进行测定的结果表明：3种中药对分离株均有较好的抑制作用，其中,以蒲公英的抑菌效果最强，这为防治延边地区仔猪大肠杆菌病中药的筛选及研究提供了理论依据。因中药单味应用效果相对较弱，为了提高中药的抗菌效果，将进一步研究中药的联合应用。

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Isolation and identification ofEscherichiacolifrom swine and in vitro antibacterial test

ZHANG Yu, LI Jinxia, XU Lu, LIU Xinyu, WANG Ying, ZHANG Xuemei*

(AnimalMedicineDepartment,AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

Fifty-two samples ofEscherichiacoliwere collected from Yanbian pig areas for isolation, identification and pathogenicity study. The effects of tetracycline, sulfadiazine and streptomycin onEscherichiacoliwere analyzed by Disk diffusion method. The minimum inhibitory concentration (MIC) and antimicrobial effect of crude extract of taraxacum, forsythia and bupleurum onEscherichiacoliwere determined by Two-fold dilution method and Oxford cup method. The results showed that 28 strains ofEscherichiacoliwere isolated and identified, the separation rate was 54%, 79% of isolated strains could kill mice; the sensitivity of tetracycline and sulfadiazine was lower, the resistance rates were 89% and 64%. The MIC of the crude extract of taraxacum was 0.05 g/mL, the MIC of the extract of forsythia and bupleurum were 0.1 g/mL, and the three crude extracts could inhibit the growth of Escherichia coli, and taraxacum had the strongest antibacterial effect. The results showed thatEscherichiacoliwas resistant to antibacterial, the antimicrobial effects of taraxacum, bupleurum and forsythia were obvious, which provided the basis for the prevention and control ofEscherichiacolidisease and the development of new drug in piglet diarrhea in Yanbian areas.

piglets;Escherichiacoli; isolation and identification; minimum inhibitory concentration; antibacterial effects

2017-02-02 基金项目：国家自然科学基金项目(31660727, 31260622 和 31060349)；吉林省科技厅重点科技攻关项目(20160204016NY)

张瑜(1994—)，女(满族)，吉林永吉人，在读硕士，研究方向为兽医药理学与毒理学研究。张雪梅为通信作者，E-mail：zhangxm@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)01-0055-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.01.009

S852.61

A