miR-122a 对大鼠脊髓缺血/再灌注损伤后血-脊髓屏障的影响

方 波，张 颖，马 虹

(中国医科大学附属第一医院麻醉科，辽宁 沈阳 110001)

miR-122a 对大鼠脊髓缺血/再灌注损伤后血-脊髓屏障的影响

方 波，张 颖，马 虹

(中国医科大学附属第一医院麻醉科，辽宁 沈阳 110001)

目的 探讨miR-122a对脊髓缺血/再灌注损伤后血-脊髓屏障的影响。方法 SD大鼠36只，随机分为3组：假手术组(S组)、对照组(C组)、miR-122a反义寡核苷酸(miR-122a antagomir)组(M组)。S组开胸游离主动脉弓，但不阻断；C组和M组开胸阻断主动脉弓14 min造成脊髓缺血/再灌注损伤。M组和C组脊髓缺血/再灌注损伤后，鞘内注射miR-122a antagomir或空白对照，每日1次，共3次。Real-time PCR测定损伤节段脊髓组织的miR-122a表达，Western blot测定脊髓组织中紧密连接蛋白occludin表达，伊文思蓝测定血-脊髓屏障通透性，Basso Beattie Bresnahan评分法评价神经运动功能。结果 与S组比较，C组miR-122a表达增加，occludin表达减少，血-脊髓屏障通透性增加，神经运动功能评分降低(P<0.05)。与C组比较，M组miR-122a表达降低，occludin表达增加，血-脊髓屏障通透性降低，神经运动功能评分增加(P<0.05)。结论 miR-122a参与调控脊髓缺血/再灌注损伤后occludin表达，影响血-脊髓屏障通透性。

缺血/再灌注损伤；脊髓；血-脊髓屏障；miR-122a；紧密连接蛋白；occludin

脊髓缺血/再灌注损伤是胸腹主动脉瘤手术最严重的并发症，是急需攻克的难题。血-脊髓屏障破坏是脊髓损伤的重要继发病理改变，而且进一步加重脊髓损伤[1]。MicroRNA在转录后水平调控基因表达，是目前研究基因治疗和寻找药物靶点的重要工具。最近研究证实，miR-122a介导紧密连接蛋白occludin 的mRNA降解增加肠道通透性[2-3]。有关miR-122a在脊髓损伤中的作用及可能的机制目前尚不清楚。本研究拟探讨miR-122a对脊髓缺血/再灌注损伤后血-脊髓屏障的影响及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 动物选择与分组 SD大鼠36只，由中国医科大学实验动物中心提供，体质量200～250 g。采用随机数字表法，随机分为3组(n=12)：假手术组(S组)、对照组(C组)、miR-122a反义寡核苷酸(miR-122a antagomir)组(M组)。S组开胸游离主动脉弓，但不阻断；C组和M组开胸阻断主动脉弓14 min造成脊髓缺血/再灌注损伤。M组和C组在脊髓缺血/再灌注损伤后30 min鞘内注射20 μL miR-122a antagomir(20 μmol·L-1，广州锐博公司)，每日注射1次，共3次。C组脊髓缺血/再灌注损伤后鞘内注射等量miR-122a antagomir空白对照。实验室光照时间6 ∶00～18 ∶00，温度控制在18℃～22℃，造模后分笼饲养，保证充足的水和食物。

1.2 脊髓缺血/再灌注损伤模型的建立 大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)麻醉，经气管切开处行气管内插管机械通气。直肠内置入温度传感器，持续监测体温，应用电热毯维持核心温度(37.5±0.5) ℃。脊髓缺血/再灌注损伤模型参照文献[4]制备。左颈总动脉置管测量近端动脉血压，尾动脉置管测量远端血压。摆右侧卧位，于左前肢和肩胛下角间行横切口，逐层分离暴露肋骨，于第2、3肋之间暴露胸腔，分离并显露主动脉弓。皮下注射肝素(200 IU·kg-1)，于左颈总动脉和左锁骨下动脉之间夹闭主动脉，阻断14 min后开放动脉夹，造成脊髓缺血/再灌注损伤。关胸，逐层缝合。术后将动物放置28℃的保温箱内，等待动物苏醒后回笼饲养。

1.3 Real-time PCR 脊髓缺血/再灌注损伤后72 h，取新鲜缺血节段脊髓组织，根据TRIzol操作说明，提取细胞总RNA。提取的总RNA定量后，对于蛋白编码基因使用Oligo(dT)作为逆转录引物，对于miRNA使用miRNA特异的逆转录引物，使用反转录试剂盒合成cDNA第一链。使用适量的cDNA作为PCR模板，MX3000P Real-time PCR 扩增仪进行PCR 反应，SYBR染料实时检测扩增产物的量，以GAPDH为内参分析蛋白编码基因表达情况，以U6 为内参分析miRNA的表达情况。所使用引物序列如下：U6 上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH上游引物5′-TCAACGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′，GAPDH下游引物5′-GCTGGTGGTCCAGGGGTCTTACT-3′。

1.4 Western blot 脊髓缺血/再灌注损伤后72 h，取新鲜缺血节段脊髓组织，迅速液氮冷冻保存。标本取齐后，剪碎，加组织裂解液，冰上匀浆，4℃离心15 min，取其上清液，BCA法蛋白定量，经电泳、转膜、醋酸纤维素膜包被后，加入兔抗大鼠occludin一抗(1 ∶500，Invitrogen公司)，4℃孵育过夜，加入HRP标记的羊抗兔 IgG二抗，室温孵育2 h，TBST冲洗，化学发光，凝胶成像系统拍摄。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对其进行半定量分析。

1.5 血-脊髓屏障通透性测定 脊髓缺血/再灌注损伤后72 h，经鼠尾静脉缓慢注射2% 伊文思蓝10 mL·kg-1，1 h后麻醉，经左心室灌注生理盐水500 mL·kg-1，取出脊髓缺血节段(L4-6)，迅速放入40 g·L-1多聚甲醛中，24 h后依次置于150、200、300 g·L-1的蔗糖中沉糖，沉糖完毕后包埋，冰冻切片，置于荧光显微镜绿色激光下观察。依照荧光光斑的大小、疏密、强弱来评价脊髓组织中伊文思蓝外渗量。

1.6 大鼠神经运动功能评价 采用Basso Beattie Bresnahan(BBB)评分标准对大鼠下肢运动神经功能进行评价。

2 结果

2.1 Real-time PCR检测脊髓组织中miR-122a表达 与S组(1.00±0.07)相比，C组miR-122a表达(3.78±0.46)增高(P<0.05)；与C组相比，M组miR-122a表达(1.74±0.27)降低(P<0.05)，Fig 1。

Fig 1 miR-122a expression at 72 h after spinal

S:Sham; C: control; M:miR-122a antagomir.*P<0.05vsS group;#P<0.05vsC group

2.2 Western blot 检测脊髓组织中occludin表达 与S组(1.00±0.06)相比，C组occludin表达(0.28±0.04)降低(P<0.05)；与C组相比，M组occludin表达(0.55±0.06)增加(P<0.05)，Fig 2。

Fig 2 Occludin expression at 72 h after spinal

S:Sham; C: control; M:miR-122a antagomir.*P<0.05vsS group;#P<0.05vsC group

2.3 血-脊髓屏障通透性 脊髓缺血/再灌注损伤后，血-脊髓屏障破坏，通透性增加，与S组(1.00±0.08)相比，C组伊文思蓝外渗量(6.12±0.73)增加(P<0.05)；与C组相比，M组伊文思蓝外渗量(3.24±0.38)减少(P<0.05)，Fig 3。

Fig 3 Permeability of blood-spinal cord barrier at

A:Evans blue extravasation fluorescence;B:Quantitative analysis of evans blue extravasation.S:Sham; C: control; M:miR-122a antagomir.*P<0.05vsS group;#P<0.05vsC group

2.4 大鼠神经运动功能 与S组(21.0±0.0)比较，C组BBB评分(7.2±1.1)降低(P<0.05)；与 C组比较，M组BBB评分(13.7±2.8)增高(P<0.05)，Fig 4。

S:Sham; C: control; M:miR-122a antagomir.*P<0.05vsS group;#P<0.05vsC group

3 讨论

脊髓缺血/再灌注损伤是胸腹主动脉瘤手术最严重的并发症之一，可引起脊髓功能障碍，甚至截瘫。血-脊髓屏障与血-脑屏障相似，是一个复杂的细胞系统，调节脊髓液体微环境在较小的范围内波动，对维持中枢神经系统的内环境稳定起着非常重要的作用[5]。脊髓缺血/再灌注损伤后，血-脊髓屏障完整性破坏，通透性增加，造成脊髓组织水肿、炎症以及神经元凋亡，进一步加重脊髓损伤[6-9]。紧密连接是血-脊髓屏障的结构和功能基础，occludin是第一个被分离出的组成紧密连接的完整膜蛋白，主要参与微血管内皮细胞间紧密连接的形成。研究发现，脊髓缺血/再灌注损伤后occludin表达减少，导致血-脊髓屏障通透性增加[10]，但其机制尚不完全明确。

MicroRNA属于调控RNA家族一员。当非编码小RNA与靶mRNA完全或不完全配对时，可引起mRNA降解，或发生在mRNA水平上诱导特异性序列基因表达部分或完全抑制的过程[11]。miR-122a作为肝脏特异性高表达的microRNA，对其研究多集中在肝癌的发生发展中[12-13]。最近研究表明，miR-122a也负向调控紧密连接蛋白occludin的表达[2,3,14]，参与内皮细胞通透性调节，影响病理生理功能。

本研究发现，脊髓缺血/再灌注损伤后miR-122a表达上调，同时伴随occludin表达减少，血-脊髓屏障破坏。反义寡核苷酸在miRNA 功能研究中是沉默miRNA的最常用，且行之有效的方法[15]。本研究鞘内注射miR-122a antagomir抑制了miR-122a表达，而且增加occludin表达，减轻血-脊髓屏障破坏，改善大鼠神经运动功能。

综上所述，miR-122a在脊髓缺血/再灌注损伤中通过调控血-脊髓屏障紧密连接蛋白occludin，进而发挥重要的作用。将其作为靶点，将为预防和治疗脊髓损伤提供新思路。

(致谢：本实验在中国医科大学附属第一医院实验中心、麻醉科实验室完成，在此特对以上实验室和实验过程中给予指导和帮助的老师表示感谢！)

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Effects of miR-122a on blood-spinal cord barrier after spinal cord ischemia-reperfusion injury in rats

FANG Bo，ZHANG Ying，MA Hong
(DeptofAnesthesiology,theFirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

Aim To investigate the effects of miR-122a on blood-spinal cord barrier after spinal cord ischemia-reperfusion injury in rats.Methods Thirty-six SD rats were randomly divided into three groups：group of sham(S group), group of control(C group) and group of miR-122a antagomir(M group). Rats in S group were subjected to exposure of aorta arch but without occlusion. Spinal ischemia-reperfusion injury was induced by clamping the aorta arch for 14 min in C group and M group. Rats in M group and C group were intrathecally injected with miR-122a antagomir or antagomir control daily for three times after injury. The miR-122a expression in injured spinal cord tissue was detected by real-time PCR. The occludin expression in injured spinal cord tissue was detected by Western blot. The permeability of blood-spinal cord barrier was examined using evans blue as a vascular tracer. The neurological motor function was evaluated by Basso Beattie Bresnahan score.Results Compared with S group, the expression of miR-122a was increased, the expression of occludin was decreased, the permeability of blood-spinal cord barrier was increased, and neurological motor function score was decreased significantly in C group(P<0.05). Compared with C group, the expression of miR-122a was decreased, the expression of occludin was increased, the permeability of blood-spinal cord barrier was decreased, and neurological motor function score was increased significantly in M group(P<0.05).Conclusion miR-122a can regulate the expression of occludin and change the permeability of blood-spinal cord barrier.

ischemia-reperfusion injury；spinal cord；blood-spinal cord barrier；miR-122a；tight junction protein；occludin

2016-12-19,

2017-01-25

辽宁省博士科研启动基金项目( No 20141035)； 国家自然科学基金资助项目(No 81401000)

方 波(1979-)，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：围术期中枢神经系统保护，通讯作者，Tel:024-83283100,E-mail：drunk0630@126.com

时间：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.044.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.022

A

1001-1978(2017)05-0703-04

R-332；R322.81；R341；R342.4；R619.9