DAT1 和DRD4 基因启动子区甲基化与注意缺陷多动障碍临床症状的关联研究☆

王少华丁凯景刘瑞湘张婕杨润许周惠至杨晨刘璐康传媛

·论 著·

DAT1 和DRD4 基因启动子区甲基化与注意缺陷多动障碍临床症状的关联研究☆

王少华*丁凯景*刘瑞湘*张婕*杨润许*周惠至*杨晨*刘璐△康传媛*

目的 探索注意缺陷多动障碍（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD）患儿多巴胺转运体基因（dopamine transporter gene，DAT1）、多巴胺D4受体基因（dopamine receptor D4 gene，DRD4）启动子区CpG岛甲基化状态与其临床症状严重程度的相关性。 方法 收集111例ADHD患儿精神类疾病家族史资料，并采用ADHD症状分级父母评定量表（attention deficit hyperactivity disorder rating scale-Ⅳ home version，ADHD-RS-Ⅳ）及自编对立违抗障碍（oppositional defiant disorder，ODD）量表对患者临床症状进行评定。采用亚硫酸氢钠测序法，检测患者外周血的DAT1、DRD4启动子区CpG岛目标片段甲基化状态。 结果 无抑郁、焦虑和ADHD家族史的患儿DAT1启动子区甲基化水平高于有抑郁、焦虑或ADHD家族史的患儿（P＜0.05）。DAT1和DRD4甲基化水平在ADHD-RS-Ⅳ总分（≤30分组与＞30分组）、注意缺陷因子分（≤17分组与＞17分组）、多动冲动因子分（≤13分组与＞13分组）低分和高分组的比较中差异均无统计学意义（均P＞0.05）。ODD量表＜9分的患儿DAT1甲基化水平较ODD量表得分≥9分的患儿高（P＜0.05），且患儿DAT1甲基化水平与ODD量表得分呈负相关（r=-2.203，P=0.033)。 结论 DAT1启动子区甲基化水平可能影响ADHD患者对立违抗行为的严重程度，且与患者有无抑郁、焦虑和ADHD家族史存在一定关系。

注意缺陷多动障碍 DNA甲基化 多巴胺转运体基因 多巴胺D4受体基因

注意缺陷多动障碍（attention deficit hyperactivity disorder,ADHD）主要表现为与年龄不相符的注意力易分散、多动冲动伴对立违抗障碍及情绪障碍。ADHD的发病机制尚未完全阐明，但目前普遍认为其为遗传性疾病，双生子研究发现其遗传率为76%[1]。目前研究得最为充分的两个候选功能基因为多巴胺转运体基因（dopamine transporter gene，DAT1）和多巴胺受体D4基因（dopamine receptor D4 gene，DRD4）[2]。另一方面，越来越多证据表明，ADHD是由基因和环境相互作用的结果[3]。表观遗传学是连接基因与环境因素的桥梁，其形式包括基因甲基化[4]、组蛋白修饰和染色质重塑等。其中启动子区CpG岛的异常甲基化被认为是一些疾病的稳定特征，可以改变相应基因的表达水平，从而影响疾病的发生及严重程度。目前国内尚未见研究探索ADHD两个易感基因DAT1、DRD4启动子区甲基化状态对症状的影响。为此，本研究采用亚硫酸氢钠测序法对111例ADHD患儿DAT1、DRD4启动子区CpG岛甲基化状态进行检测，探索其甲基化水平与ADHD临床症状严重程度的关联。

1 对象与方法

1.1 研究对象 ADHD患儿来自于2010年11月至2013年12月至昆明医科大学第一附属医院精神科门诊就诊的患者。纳入标准：①5～15岁，性别不限；②汉族；③符合《美国精神障碍诊断与统计手册第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition，DSM-Ⅳ）ADHD诊断标准，由1名副高职称儿童精神科医师通过询问病史、体检、量表初筛及智力和认知检查作出临床诊断，再经另1名主治医师通过儿童临床诊

断性会谈量表（clinical diagnostic interview scale，CDIS）与家长进行半定式访谈核实诊断。排除标准：①患有癫痫、精神发育迟滞（智力商数＜70分），或其它符合DSM-Ⅳ轴Ⅰ诊断的精神障碍（对立违抗障碍除外）；②有严重慢性躯体疾病病史。所有入组患儿均由父母签署知情同意书。本项目通过昆明医科大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.2 研究工具

1.2.1 一般资料 患儿一般资料由患儿父母提供，父母在就诊时填写自编调查表，内容包括患儿性别、年龄、精神类疾病家族史（包括与患者具有血缘关系的直系、旁系亲属）。根据目前主流的精神疾病发病相关假说，将精神类疾病家族病史分为：①缺乏多巴胺的疾病，包括抑郁[5]、焦虑[6]、ADHD；②多巴胺过多的疾病，包括精神分裂症[7]。

1.2.2 儿童临床诊断性会谈与韦氏儿童智力测试

采用CDIS量表对儿童家长进行半定式访谈，确定ADHD诊断和其他共患病情况。采用龚耀先修订的中国韦氏儿童智力量表（Chinese Wechsler intelligence scale for children，C-WISC）评定被试患儿的智力商数（intelligence quotient，IQ）。量表评估均在患儿初入组未用药时进行，由我院专业的心理测量师施测。

1.2.3 ADHD症状评估 ADHD症状分级父母评定量表（attention deficit hyperactivity disorder rating scale-Ⅳhome version，ADHD-RS-Ⅳ）根据DSM-Ⅳ中ADHD的诊断标准编制而成，由患儿父母填写。该量表共18项条目，各条目采用4级评分法（0～3分表示症状从“无”到“非常多见”），1～9项得分为注意缺陷分（inattention score，I分），10～18项得分为多动冲动分（hyperactivity/impulsivity score，HI分），18项条目得分之和为临床症状总分[7]。以入组患儿该量表得分的中位数为界值，将其划分为高分组和低分组。

1.2.4 对立违抗症状评估 根据DSM-Ⅳ中对立违抗障碍（oppositional defiant disorder,ODD）的8项条目自编量表。各条目按照行为出现的频率采用4级评分法（1～4分表示从“无”到“常见”），8项条目的总分反映对立违抗行为的程度。以入组患儿该量表得分的中位数为界值，将其划分为高分组和低分组。

1.3 DAT1、DRD4启动子区CpG岛甲基化状态检测

1.3.1 标本采集及DNA提取 入组儿童每例采集外周静脉血2～3 mL，EDTA抗凝，-80℃冰箱保存，2周内采用柱式小量血液基因组DNA抽提试剂盒（上海华舜生物技术有限公司）提取DNA并检测纯度与浓度。

1.3.2 DNA甲基化水平检测及目标片段选定 使用DNA甲基化试剂盒EZ DNA Methylation-Gold Kit（美国ZYMO RESEARCH公司），按照操作说明书对样本DNA进行亚硫酸氢盐修饰。采用亚硫酸氢钠测序法检测DAT1、DRD4启动子区CpG岛甲基化水平。应用美国国立生物技术信息中心（NCBI）中的BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ blast.cgi）设计引物。DRD4外扩引物为 5’-G AATTTTTTGTTGYGTTTTGTAAGTAT-3’，5’-GCC AAACGCAAAAAAACCTAAACTC-3’，内扩为5’-TTGTTGYGTTTTGTAAGTATTTTTTT-3’，5’-CAAC CTCTAACCCTCAACCCC-3’；DAT1外扩引物为5’-TTAGGGGCGACGTATAGAGTTGG-3’，5’-CCGCT CCACGCTCTAACCAA-3’，内扩为5’-GGTTTGGG GGTTTTATTTTTT-3’，5’-AATCCTTCCGTAACCTT AAAATCTC-3’。应用Takara LA Taq/Takara Ex Taq对亚硫酸氢盐处理后的基因组DNA进行两次降落PCR（touch down PCR）扩增。外扩反应体系12.5 μL，含模版DNA 4 μL、上下游引物（20 μmol/L）各0.25 μL、TaKaRa LA Taq 0.125 μL、10×LA PCR Buffer II 1.25 μL、dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）2 μL；反应条件为95℃预变性5 min，95℃变性30 s、62℃退火30 s（每循环降落2℃）、72℃延伸1 min，7个循环，72℃链接10 min，4℃保持。内扩反应体系50 μL，含模版DNA 2 μL、上下游引物（20 μmol/L）各1 μL、TaKaRa Ex Taq 0.25 μL、10× Ex Taq Buffer II 5 μL、dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL；反应条件为95℃预变性5 min，95℃变性30 s、62℃退火30 s（每循环降落1℃）、72℃延伸1 min，13个循环，72℃链接 10 min，4℃保持。用Wizard SV Gel and PCR Clean-up System试剂盒（美国Promega）及Competent Cell Preparation Kit（宝生物大连工程有限公司）对扩增产物进行纯化、连接质粒载体、挑单克隆，测序（上海生工生物工程公司）后与原序列对比，获得候选基因DAT1、DRD4启动子区甲基化水平。使用UltraEdit32软件编辑整理DNA甲基化测序所得碱基序列，计算每例患者DAT1和DRD4基因的甲基化水平。甲基化水平=实际甲基化位点数目/目标片段中可甲基化位点总数×100%。

1.4 统计学方法 所有数据采用EpiData 3.1软件双录入核对后转入SPSS 17.0进行统计分析。甲基化水平为非正态分布数据，采用中位数（下四分位数，上四分位数）[M（QL，QU）]描述，Mann-Whitney U秩和检验进行组间比较，患儿甲基化水平与各症状量表评分的关系采用Spearman相关分析。检验水准α为0.05，双侧检验。对统计检验中的阴性结果，使用G*power软件计算统计效力（1-β）值。

2 结果

2.1 临床资料及DAT1、DRD4甲基化情况 111例ADHD患儿均完成候选基因甲基化检测。患儿中男97例（87.4%），女14例（12.6%）；年龄5～15岁，平均（9.25±2.08）岁；所用患者均未接受过药物治疗；有精神类疾病家族史者31例（27.9%），其中有抑郁、焦虑或ADHD家族史者26例（23.4%），有精神分裂症家族史者5例（4.5%）。患儿ADHDRS-Ⅳ总分中位数为30（24，38）分，I分和HI分分别为17（14，21）分和13（8，18）分；ODD分中位数9（5，12）分。

DAT1启动子区甲基化率中位数为 16.0%（8.0%，28.0%），最高为100.0%（1例），最低为0.0%（8例）；DRD4启动子区甲基化率中位数为78.3%（70.0%，82.6%），最高100.0%（2例），最低为47.8%（1例）。

2.2 不同家族史情况患儿DAT1、DRD4甲基化水平 无抑郁、焦虑和ADHD家族史的患者DAT1甲基化水平高于有抑郁、焦虑或ADHD家族史的患者，差异有统计学意义（Z=-3.236，P=0.001），而两者DRD4甲基化水平差异无统计学意义（Z=-0.056，P=0.955），其（1-β）值均为0.60，见表1。有无精神分裂症家族史的患儿DAT1与DRD4甲基化水平差异均无统计意义（P＞0.05），其（1-β）均值为0.19。

2.3 不同临床症状患儿DAT1、DRD4甲基化水平

ADHD-RS-Ⅳ量表总分及其I分、HI分的低分和高分组间DAT1和DRD4甲基化水平分别比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），其（1-β）值均为0.74。ODD量表分≤9分组的DAT1甲基化水平高于＞9分组（Z=2.726，P=0.006），而两者DRD4甲基化水平差异无统计学意义（P＞0.05），其（1-β）值为0.73。见表2。

2.4 DAT1、DRD4甲基化水平与症状相关性 患儿DAT1甲基化水平与ODD量表分呈负相关（r=-0.203，P=0.033），但与ADHD-RS-Ⅳ量表总分、I分、HI分的相关均无统计学意义（均P＞0.05）。DRD4甲基化水平与ADHD-RS-Ⅳ量表总分、I分、HI分、ODD量表分相关均无统计学意义（均P＞0.05）。

3 讨论

既往多项研究提示前额叶多巴胺（dopamine，DA）功能低下和ADHD相关[8]，而DAT1和DRD4是与多巴胺功能密切相关的两个基因。DAT1编码Na+和Cl-依赖的多巴胺转运体蛋白，该蛋白位于中枢神经系统DA神经元突触前膜，能再摄取突触间隙DA，中止神经细胞信号传递，影响DA突触间隙的浓度和作用时间；DRD4编码DA的第四种G蛋白偶联受体，该受体位于中枢神经系统DA神经元突触后膜，影响神经细胞信号的传递。

本研究提示有抑郁、焦虑或ADHD家族史的患儿DAT1甲基化水平低于无相关家族史的ADHD患儿。DAT1甲基化水平低可能提示中枢神经系统DA处于低水平，而存在抑郁、焦虑或ADHD的个体也有低DA水平情况[8]，提示父代的低DA水平可能遗传给子代，因此本结果在一定程度上从侧面支持ADHD是遗传性的疾病[9]。

DADDS等[10]研究提示DRD4甲基化水平与ADHD患儿注意缺陷及认知障碍相关，HASLER等[11]的研究提示DAT1甲基化水平与多动冲动症状相关，而本研究中DAT1和DRD4甲基化水平与ADHD临床症状严重程度的相关性无统计学意义。但由于本研究样本量小，统计检验的把握度不高，故此结果还需扩大样本量进一步证实。

表1 有无抑郁、焦虑、ADHD家族史患儿DAT1、DRD4启动子区甲基化水平[M（QL,QU）]

表2 各症状量表不同得分患儿DAT1、DRD4启动子区甲基化水平[M（QL,QU）]

对立违抗障碍是一种以针对成人和权威表现出违抗、敌意和冲动行为特征的外显性行为障碍，常与ADHD共患，其共患率约35%～65%，共患对立违抗障碍可进一步加重ADHD患者的社会功能损害[13]。哌醋甲酯可通过提高中枢神经系统DA的功能而改善ODD症状，提示ODD症状可能与中枢神经系统低DA水平相关[14]。既往也有研究提示DAT1参与ODD的发生[15]，然而，尚无研究报道DAT1甲基化水平与ODD症状相关。DAT1启动子区的低甲基化水平可能导致DAT1的表达水平增高，DAT数量增多，神经元细胞突触间DA水平下降[16]。本研究发现ODD症状重的患儿其DAT1甲基化水平低，进一步支持中枢神经系统DA的水平和ODD症状相关，但该结论还需在其他独立样本中进一步证实。

本研究尚存在一些缺陷。首先，甲基化存在组织特异性，本研究检测DAT1、DRD4甲基化选用的外周血液样本，无法完全代表脑组织中的甲基化状态。此外，DAT1、DRD4甲基化水平只是影响脑中DA浓度的一个方面，还需进一步研究基因甲基化、转录、翻译到蛋白表达的这一复杂过程才能全面阐述ADHD临床症状与DA水平及DAT1、DRD4的相关性。第三，本研究的所有阴性结果把握度均较低，所得结论需扩大样本进一步证实。

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Association between methylation status of CpG island in DAT1 and DRD4 genes and clinical symptoms ofADHD.

WANG Shaohua,DING Kaijing,ZHANG Jie,YANG Runxu,ZHOU Huizhi,YANG Chen,LIU Lu,KANG Chuanyuan.Department of Psychiatry,the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Yunnan 650032, China.Tel:0871-65324888.

Objective To investigate the correlation of methylation status in DAT1 and DRD4 genes and severity of clinical manifestations in ADHD patients.MethodsOne hundrd eleven DSM-Ⅳ defined ADHD patients were enrolled in this study and the demographic data were collected.Clinical symptoms were also assessed by Attention Deficit Hyperactivity Disorder Rating Scale-Ⅳ Home Version(ADHD-RS-Ⅳ)and self-developed Oppositional Defiant Disorder(ODD)rating scale.Bisulfite genomic sequencing(BGS)was used to detect the methylation status of every CpG site in DAT1 and DRD4 promoter CpG island in peripheral venous blood.ResultsThe DNA methylation level in total CpG island for DAT1 was higher in individuals without depression,anxiety or ADHD family history compared to individuals with above family histories (P＜0.05).The differences on methylation levels for DAT1 and DRD4 were not significant between high and low ADHD-RS-Ⅳtotal score (≤30 vs.＞30),ADHD-RS-Ⅳinattention score(≤17vs.＞17),and ADHD-RS-Ⅳhyperactivity/impulsivity score (≤13 vs.＞13)subgroups (all P＜0.05).The methylation levels in total CpG island in DAT1 was higher in individuals whose ODD score were＜9 compared to those whose ODD score were≥9 (P＜0.05).Conclusions Methylation status of CpG island in DAT1 may influence the severity of oppositional defiant symptom in ADHD patients,which is correlated with depression,anxiety and ADHD family histories.

Attention deficit hyperactivity disorder DNA methylation Dopamine transporter gene(DAT1/ SLC6A3)Dopamine receptor D4 gene(DRD4)

R749.94

A

2016-08-29)

(责任编辑：肖雅妮)

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.02.007

☆国家自然科学基金（编号：30900488，81460218）；国家科技支撑计划项目（编号：2015BAI13B01）

* 昆明医科大学第一附属医院精神科（昆明 650032）

△国家精神心理疾病临床医学研究中心（北京大学第六医院）