3种核酸提取方法及3种实时荧光定量PCR仪检测结果的比较

吴秋华 张勇建 田真 李红东 李政 司拨云 许文波 许松涛

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 卫生部医学病毒和病毒病重点实验室(吴秋华、许文波、许松涛)；073000 定州，河北省定州市人民医院(张勇建)；710018 西安天隆科技有限公司(田真、李红东、李政)；101101 北京市通州区卫生监督所(司拨云)

·技术方法·

3种核酸提取方法及3种实时荧光定量PCR仪检测结果的比较

吴秋华 张勇建 田真 李红东 李政 司拨云 许文波 许松涛

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 卫生部医学病毒和病毒病重点实验室(吴秋华、许文波、许松涛)；073000 定州，河北省定州市人民医院(张勇建)；710018 西安天隆科技有限公司(田真、李红东、李政)；101101 北京市通州区卫生监督所(司拨云)

目的 探讨不同核酸提取方法以及不同实时荧光定量PCR仪检测结果之间的差异。方法 随机挑选呼吸道、肠道病毒阳性标本各25份，采用3种方法(方法A、B、C)进行核酸提取，比较不同核酸提取方法之间的差异；随机挑选呼吸道、肠道病毒阳性核酸各25份，在3种实时荧光定量PCR仪(仪器A、B、C)上进行实时荧光定量PCR，比较不同实时荧光定量PCR仪之间的差异。检测结果采用定量资料的随机区组方法分析。结果 3种核酸提取方法检测结果存在差异(χ2=42.9162,P<0.001)，其中方法A、B，方法B、C之间的差异具有统计学意义(Z=7.025,P<0.001；Z=7.9,P<0.001)，方法A、C之间的差异无统计学意义(Z=0.837,P=0.3816>0.05)。3种实时荧光定量PCR仪的检测结果也存在差异(χ2=23.773,P<0.001)，其中仪器A、B，仪器A、C之间的差异有统计学意义(Z=5.70,P<0.001；Z=6.45,P<0.001)，仪器B、C之间的差异无统计学意义(Z=0.75,P=0.4533>0.05)。结论 在相同条件下，用不同的核酸提取方法，以及用不同的实时荧光定量PCR仪检测的结果均有差异，在实际工作中要综合考虑评价检测结果。

Fund programs: National major scientific instrument and equipment development foundation of China (2012YQ030261); National key research and development project (2016YFC1200905)

自从穆利斯发明PCR技术以来，使生命科学研究得到了快速发展，PCR技术作为生物技术的一次重大革命，已经渗透到生命科学研究及应用的各个领域，成为了生物学的基础技术[1]。为PCR相关检测应用而生的核酸提取方法也受到了生物学者的广泛关注和研究，特别是近年来数字PCR，高通量PCR的出现为核酸提取质量和通量提出了更高要求。在此背景下各种核酸提取技术取得了长足发展，不仅试剂分类详细，还出现了与之相配套的核酸提取仪器[2,3]。

为了探讨不同核酸提取方法以及不同实时荧光定量PCR仪的实际性能，本研究选取了3种核酸提取方法以及3种实时荧光定量PCR仪进行平行实验，以考察不同提取方法和不用仪器对检测结果的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂 呼吸道、肠道病毒RNA阳性标本各25份；Ex-DNA/RNA型核酸提取试剂盒购自苏州天隆生物科技有限公司；Qiagen核酸提取试剂盒购自德国Qiagen公司；荧光PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。

1.2 实验设备 NP968核酸提取仪购自西安天隆科技有限公司；QIAcube全自动核酸提取仪购自德国Qiagen公司；ABI7500实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；Bio-rad CFX96实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-rad公司；TL988-IV型实时荧光定量PCR仪购自西安天隆科技有限公司。

1.3 核酸提取及实时荧光定量PCR检测 核酸提取：按照核酸提取试剂盒提供的操作方法提取样本中的RNA核酸，置于-20 ℃保存备用。实时荧光定量PCR扩增：采用呼吸道、肠道病毒的特异引物，按照以下反应条件进行： 50 ℃ 30 min；95 ℃ 10 min，45×(95℃ 10 s，55 ℃ 40 s)：采集荧光。反应体系为25 μl。按照仪器说明进行结果判断。1.4 实验方法 研究采用随机区组的方法设计两个不同的实验，分别对不同的核酸提取方法、不同的实时荧光定量PCR仪进行平行实验，具体实验如下：

实验一，随机挑选呼吸道、肠道病毒RNA阳性标本各25份，分别用NP968核酸提取仪(方法A)，Qiagen核酸手动提取试剂盒(方法B)及QIAcube全自动核酸提取仪(方法C)，配套各自匹配的提取试剂，进行核酸提取；然后在Bio-rad CFX96型实时荧光定量PCR仪上，使用相同的试剂，相同的条件，分别进行实时荧光定量PCR扩增检测，记录样品Ct值。每个样本的每种提取方法做2个复管扩增检测。对样品Ct值的资料采用随机区组分析。

实验二，随机挑选呼吸道、肠道RNA阳性标本各25份，采用实验一中方法C进行核酸提取纯化，所得的核酸产物，同时在ABI7500型(仪器A)、Bio-rad CFX96型(仪器B)、以及TL988-IV型(仪器C) 实时荧光定量PCR仪上，使用相同的试剂，相同的条件，分别进行实时荧光定量PCR扩增检测，记录样品Ct值。同一样本的上样量一致，以保证样本的均质性。每个核酸产物做2个复管扩增检测。对样品Ct值的资料采用随机区组分析。

1.5 统计学方法 本研究实验选用定量资料的随机区组方法进行分析：首先对定量资料(3种提取方法或3种仪器测定的Ct值)分别进行正态分析。若资料符合正态分布，且各组方差齐，将采用随机区组的方差分析。如果检测结果有统计学意义，将进一步作两两比较。若资料不符合正态分布，将采用非参数检验的Friedman法。如果检测结果有统计学意义，则进一步作两两比较。

2 结果

2.1 3种核酸提取方法的结果比较 对同一组样本，用不同的方法提取核酸，在相同条件下，进行实时荧光定量PCR扩增后，所得Ct值采用SAS 9.4统计软件分析，统计量描述情况见表1。

表1 3种核酸提取方法统计量描述表

3种方法检测结果经正态性检验，P值均<0.05,均不符合正态分布，故采用随机区组的Friedman检验分析(α=0.05)，3种方法检测结果总的差异有统计学意义(χ2=42.9162,P<0.001)。3种方法检测结果两两比较结果显示，方法A与方法B之间的差异具有统计学意义(Z=7.025,P<0.001)；方法B与方法C之间的差异有统计学意义(Z=7.9,P<0.001)；方法A与方法C之间的差异无统计学意义(Z=0.837,P=0.3816>0.05)。通过对样品检测的Ct值均数的分析，方法A与方法C效果相当，均优于方法B。详见表2。

表4 3种荧光PCR仪器两两比较表Tab.4 The comparison among three kinds of real-time fluorescence quantitative PCR instruments

表2 3种提取方法两两比较表

2.2 3种实时荧光定量PCR仪检测结果的比较 以同一组核酸为模板，采用相同条件，在不同的实时荧光定量PCR仪进行扩增后，所得Ct值采用SAS 9.4统计软件，统计量描述情况见表3：

3种仪器检测结果经正态性检验，P值均<0.05,均不符合正态分布，故采用随机区组的Friedman检验分析(α=0.05)，3种仪器检测结果总的差异有统计学意义(χ2=23.773,P<0.001)。3种仪器检测结果两两比较结果显示，仪器A与仪器B所得结果之间的差异有统计学意义(Z=5.70,P<0.001)；仪器A与仪器C所得结果之间的差异有统计学意义(Z=6.45,P<0.001)；仪器B与仪器C之间的差异无统计学意义(Z=0.75,P=0.4533>0.05)。通过对样品检测的Ct值均数的分析，仪器A最为灵敏，仪器B与仪器C效果相当。复管一致性检测显示，在3种仪器上，同一个样本的复管间均具备高度的相关性(相关系数>0.990)。详见表4。

表3 3种荧光PCR仪器检测结果统计量描述表

3 讨论

目前核酸提取的方法主要有试剂盒手动提取法和全自动仪器提取法[4]。试剂盒手动提取法其原理是利用特异性物质吸附核酸，然后去除杂质，洗脱获得纯净核酸。该法步骤较多，对操作者熟练程度要求高。全自动仪器提取多采用磁珠分离法，核酸裂解释放后，特异性的吸附到磁珠外包被的硅胶膜上，磁珠被移液枪头外的磁珠固定，通过改变pH值、离液盐等条件将核酸洗脱下来。该法完全自动化，彻底去除抑制物，比手动法更为高效快捷[5,6]。

3种方法提取核酸进行荧光定量PCR检测的结果显示，在保证实验室质量控制的前提下，NP968核酸提取仪与QIAcube全自动核酸提取仪效果相当，但均比Qiagen核酸手动提取法出色。手工提取核酸，操作步骤繁琐，更易受人为操作因素影响；全自动核酸提取仪则简化了操作步骤，方便快捷；NP968全自动提取仪配备了独特的紫外杀菌消毒功能，更大程度降低污染的可能性。

现市面上的实时荧光定量PCR仪各式各样，其光学系统主要分为卤钨灯和LED两类。卤钨灯激发范围广，光强强，宜于做多通道的定量PCR；LED的激发光源为冷光源，相对寿命长，但光强度低，光的激发范围受限。本次实验中ABI7500光源为卤钨灯，而Biorad CFX96与TL988-IV光源为LED[7-9]。

3种实时荧光定量PCR仪检测结果显示，在保证实验室质量控制的前提下，ABI7500最为灵敏，Biorad CFX96与TL988-IV效果相当，可能是本次实验中采用的试剂与ABI7500更配套。在3种仪器上，同一个样本的复管间相关性均大于0.990，表明复管间高度相关。同等条件下，3种仪器实验反应时长如下: ABI7500为115 min、Biorad CFX96为118 min、TL988-IV为140 min。TL988-IV与其他两台仪器相比用时约多15%，这可能与仪器升降温方面的性能有关。在仪器软件的使用方面，ABI7500较为繁琐，需手动设置的条件较多；而Biorad CFX96与TL988-IV采用人性化的下拉式选择框，使用起来更为方便。此外，ABI7500采用卤钨灯作为光源，需要定期校准以消除边缘效应[7]。

目前对检测技术的研究多集中在方法本身，对于不同厂家的仪器关注较少，本研究提示，除方法本身外，还要考虑仪器等硬件设施的影响，仪器与试剂间配套等的系统性能的影响。在实际工作中要综合考虑评价，以保证结果的准确性和可信性。

[1] 古佳玉,安成才.T-Linker PCR技术[J].科学中国人,2003,(11):49-51.doi：10.3969/j.issn. 1005-3573.2003.11.025.

[2] 陈旭,齐凤坤,康立功,等. 实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J].东北农业大学学报, 2010, 41(8):148-155.doi：10.3969/j.issn.1005-9369.2010.08.029.

[3] 武金霞,韩凝,边红武.基于PCR原理富集低丰度DNA突变的检测技术[J].中华检验医学杂志,2014,37(12):958-963.doi：10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2014.12.022.

[4] 罗忠永,王印,杨泽晓,等.实时荧光定量 PCR 模板核酸提取方法的比较[J].动物医学进展,2016,37(11):53-56.doi：10.3969/j.issn.1007-5038.2016.11.011.

[5] 潘钰,杨明华,原韬,等.三种方法提取肠道腺病毒核酸的比较[J].黑龙江科学,2016,7(12):33-35.doi：10.3969/j.issn.1674-8646.2016.12.012.

[6] 张睿,叶阿里,窦亚玲，等.全自动核酸提取工作站对人乳头瘤病毒分型检测的可行性[J].中华医学杂志,2015,95(46):3775-3777.doi:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2015.46.013.

[7] 潘强龙,周成林,杨先知,等.ABI 7500与TL 988实时荧光PCR仪的性能评价[J].中国现代医生,2015,(2):155-156,160.

[8] ABI7300实时荧光定量PCR仪的性能评估[J].国际检验医学杂志,2015,(4):494-495.doi：10.3969/j.issn.1673-4130.2015.04.026.

[9] 王火生,李美忠,林萍,等.同一试剂在三种荧光定量PCR检测仪的应用效果及评价[J].中国医疗器械信息,2006,12(2):40-49.doi：10.3969/j.issn.1006-6586.2006.02.014.

(本文编辑：陈培莉)

Comparative study on three methods of nucleic acid extraction and three kinds of real-time fluorescence quantitative PCR instrument

WuQiuhua,ZhangYongjian,TianZhen,LiHongdong,LiZheng,SiBoyun,XuWenbo,XuSongtao

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChinaCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(WuQH,XuWB,XuST);People′sHospitalofDingzhou,HebeiProvince,Dingzhou073000,China(ZhangYJ);Xi′anTianlongScienceandTechnologyCoLtd,Xi′an710018,China(TianZ,LiHD,LiZ);HealthSupervisionInstitutionofTongzhouHealthBureau,Beijing101101,China(SiBY)

XuSongtao,Email:xsttz886@sina.com

Objective To explore the differences among three methods of nucleic acid extraction and three kinds of real-time fluorescence quantitative PCR instrument. Methods Twenty-five respiratory virus nucleic acid and 25 enterovirus nucleic acid positive samples were with selected at random and nucleic acids were extracted by using three methods (method A, B, and C). The results among different methods were analyzed by randomized block design. 25 respiratory viral nucleic acid positive specimens and enterovirus nucleic acid positive samples were detected by using three kinds of real-time fluorescence quantitative PCR instrument (instrument A, B, and C). The results among different instruments were analyzed by randomized block design.Results There was a significant difference among three methods of nucleic acid extraction in results(χ2=42.9162,P<0.001), in which method A and C had not significant difference(Z=0.837,P=0.3816>0.05), while method A vs. B, B vs. C were significantly different(Z=7.025,P<0.001;Z=7.9,P<0.001). There was also a significant difference among three kinds of real-time fluorescence quantitative PCR instrument in results(χ2=23.773,P<0.001), in which instrument B and C had no significant difference(Z=0.75,P=0.4533>0.05), while instrument A vs. B, A vs. C were significantly different(Z=5.70,P<0.001;Z=6.45,P<0.001).Conclusions There is difference among different methods and instruments in the test results under the same condition, which call for options in practical work according to need.

Nucleic acid extraction; Real-time fluorescence quantitative PCR; Randomized block design

许松涛，Email: xsttz886@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.02.018

国家重大科学仪器设备开发专项(2012YQ030261);国家重点研发计划课题：重要新发突发病原体应急处置方案与规范研究(2016YFC1200905)

核酸提取;实时荧光定量PCR;随机区组设计

2016-10-09)