CODEHOP设计简并引物克隆花羔红点鲑肌钙蛋白及其生物信息分析

茆安婷 焦 雪 巴翠玉 李月红

（吉林农业大学 动物科技学院实验室 吉林 长春 130118）

CODEHOP设计简并引物克隆花羔红点鲑肌钙蛋白及其生物信息分析

茆安婷 焦 雪 巴翠玉 李月红*

（吉林农业大学 动物科技学院实验室 吉林 长春 130118）

本实验通过无性生殖的方法得到了花羔红点鲑肌钙蛋白(Tnc)基因，并在使用生物信息学资源和生物软件的条件下，通过CODEHOP的方法对特定的氨基酸序列设计简并引物，并对得出的结果进行同源性分析同时构建其相对系统进化树。结果表明：通过CODEHOP的方法所设计出的引物简并度较其他方法得到的引物简并度低，DNA熔解温度（Tm值）修改较方便，产物具有较强的特异性；肌钙蛋白具有高度的保守性，将肌钙蛋白基因片断做结果比对，其编码的氨基酸序列与斑马鱼同源性可达96%，与大西洋鲑Salmo salar同源性为92%，白斑狗鱼Esoxlucius同源性为92%，虹鳟Oncorhynchus mykiss同源性为91%，斜带石斑鱼Epinepheluscoioides同源性为91%，斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus同源性为85%。

花羔红点鲑；简并引物； CODEHOP；肌钙蛋白

花羔红点鲑隶属于鲑形目、鲑科、红点鲑属，俗称花丽羔子，亦称多丽鲑，享有“冷水鱼之王”美誉，是一种中小型陆封鱼类，在我国仅分布于黑龙江下游及河口、绥芬河支流、图门江上游及其支流和鸭绿江上游及其支流，其中鸭绿江为我国花羔红点鲑分布的南界。然而由于自然环境的变化导致水质的下降，冷水鱼的生存环境受到了极大的威胁，为此花羔红点鲑已被我国列入《中国东北地区珍稀濒危动物志》。

肌钙蛋白C（Tro-ponin C，TnC）是一种能特异性与Ca离子结合的蛋白，其分子结构具有4个螺旋—环—螺旋的特殊结构，由于此特殊结构而具有4个潜在的Ca离子结合位点。Ca离子信号传导是机体细胞传导信号最为广泛的一种，而TnC的EF手图像也同时参与Ca离子的信号传导。TnC不仅可以与Ca离子结合还能与Mg离子结合，导致其结构变化，机体内一系列相关的酶活性及相关生理机能同时也发生了变化。而在TnC的作用下Ca离子的浓度高地，直接影响骨骼肌对肌蛋白生成，为此也会影响鱼类的生长及肉质。本实验通过CODEHOP法设计简并引物，得出其相关基因。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及样品采集 实验材料为延吉青龙采集的花羔红点鲑幼鱼心脏组织，置于液氮中保存备用。

1.1.2 试剂 TRIZol，购自Invitrogen 公司；Ex Tap酶（5 U/μL）、DNA Marker、dNTPs（2.5 mmol/L）、回收试剂盒，均购自宝生物工程（大连）有限公司；IPTG、X-gal等，购自上生工生物工程技术服务有限公司。

1.1.3 菌体和质粒 大肠杆菌DH 5α，质粒为pGEMT Easy Vector，购自Promega公司。

1.1.4 主 要数 据 库与 软件 DNAMAN、Oligo6.0、MEGA5.2、NCBI、Block Marker、CODEHOP。

1.2方法

1.2.1 设计简并引物 从NCBI数据库中检索TnC（Troponin C）基因的氨基酸序列，并从中选取具有代表性的4个序列：斑马鱼Danio rerio（Genbank登录号：NP852475）、大西洋鲑Salmo salar（Genbank登录号：ADO29385）、斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus（Genbank登录号：ADO29385）、白斑狗鱼Esoxlucius（Genbank登录号：ACO13471）。在Block Marker网站上对上述4个序列进行比对，得到高度保守的连续氨基酸序列区。从Block Marker Results 网页直接登录CODEHOP数据库进行引物设计。参数设置为：Maximum core degeneracy：128；Target clamp temperature: 60.0 ℃ Genetic code：standard；Codon usagetable：Danio rerio进行检索。

1.2.2 简并引物的筛选 筛选简并引物时，根据设计引物的普遍原则和引物退火的最低温度先筛选出一部分分值较高的引物，再根据保守区内氨基酸的位置筛选出简并度较低的引物，最后用其中一条鱼的mRNA作为模板，先利用MEGA5.2查看引物与模板mRNA 的匹配性，选择匹配度较高的引物，再利用Oligo6.0 进行引物自身的分析，引物的Tm值相差不宜超过5 ℃。

1.2.3 简并扩增 TnC序列花羔红点鲑心脏组织总RNA提取流程按照TRIZol试剂盒说明书进行操作。然后利用Oligo（dT） 20 合成cDNA 第一链，再用筛选好的简并引物进行RT-PCR扩增。PCR程序如下：95 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；循环数为30；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.4 PCR 产物的鉴定、回收、克隆及测序RTPCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测；产物利用AxyGen公司琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒进行回收，得到目的基因片段；回收片段与Promega公司克隆载体试剂盒连接入pGEM-T Easy 载体，化学转化入大肠杆菌DH 5α内，在蓝白斑筛选板上涂布，将阳性白色克隆进行菌体提取质粒酶切检测，测序由华大基因科技服务有限公司完成。

1.2.5 TnC的序列分析测序回来的片段经NCBIblast进行序列比对和同源性比较。

1.2.6 系统进化分析系统发生分析应用MEGA5.2软件分析，利用15种动物的氨基酸序列进行多重比对、构建系统进化树。

2 结果

2.1 简并引物设计结果

利用Block Marker 对4条鱼的TnC氨基酸序列进行Block 比对，得到5个高度保守的氨基酸区域。再以CODEHOP设计引物，经过筛选分析，得到1对引物，上游引物为5′-GCTGACCGAGGAGCAGaaraaygart-3′；下游引物为5′-CCTTCATGAACTCCAGGAActcrtcrtartc-3′。

2.2 简并扩增电泳结果

以总RNA为模板（见图1）用上述简并引物进行RT-PCR 扩增，得到1条片段大小为1250bp的高度特异性条带，与预测的结果基本一致。由琼脂糖凝胶电泳结果可以看见，这种引物的特异性强，没有出现非特异性条带（见图2）。图2中目的片段为TnC基因片段。

图1 总RNART—PCR扩增结果

图2 花羔红点鲑心脏组织RT-PCR电泳检测结果

2.3 TnC系统进化分析与系统进化树的构建

为了探究TnC在进化中的稳定性和保守性，本文中构建了包含15种动物TnC氨基酸序列的进化树(各动物TnC氨基酸序列Gen Bank accession number见表1)。进化树如图3。由系统进化树可见，可以分为两大支，其中一支为牛、野猪、人、猕猴、狨猴、小家鼠、褐家鼠、原鸡、白斑狗鱼、虹鳟、大西洋鲑，另一条分支上包含斑点叉尾鮰、斜带石斑鱼、鲤鱼和斑马鱼。其中硬骨鱼类单成一条分支，该分支中包含两个支叶。第一支由白斑狗鱼、红鳟、大西洋鲑组成；第二支由斑点叉尾鮰、斜带石斑鱼、鲫鱼和斑马鱼组成。通过NCBI将测序结果进行同源性比对，得出结果表明其所编码的氨基酸序列与斑马鱼的同源性最高，可达到96%，与大西洋鲑同源性为92%，白斑狗鱼同源性为92%，虹鳟同源性为91%，斜带石斑鱼同源性为91%，斑点叉尾鮰同源性为85%。

表1 14种动物TnC氨基酸序列

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图3 15种动物TnC氨基酸序列构建的系统进化树

3 讨论

在最初筛选基因时，本实验通过CODEHOP设计的简并引物，该方法避免了传统方法所造成的诸多缺点，例如无需在庞大的基因库寻找所需基因；同时降低了PCR产物的假阳性率，并且当序列间亲缘关系较远或者拷贝数较低时，传统方法一般都不适用，而CODEHOP则可以分离得到亲缘关系较远或低丰度的基因。在利用CODEHOP设计引物过程中，检索出大量的引物序列，这同样给引物筛选造成了一定的困难，本试验在结合前人经验的基础上，优化设计方法，结果证明切实可行。经查阅国内外文献发现，国内外关于动物肌钙蛋白的研究很少。本实验应用CODEHOP设计，首次设计可将部分序列成功克隆到pGEM-T载体上的花羔红点鲑TnC基因的简并引物，使目的基因可以稳定复制并进一步确定Ca2+的信号传导，为花羔红点鲑的肌肉生长和肉质研究提供重要的依据。更为探索鱼类生物学功能、有益基因的筛选及Ca2+信号传导提供了科学依据。鱼类TnC基因的研究提供了基因、蛋白质以及基因定位等方面的科学基础。构建进化树提供了生物进化方面的数据支持。

（略）

国家自然科学基金(30972191)

茆安婷(1992-)，女，硕士，从事动物疾病及免疫研究，E-mail:569711008@qq.com

*通信作者：李月红，E-mail:liyhong@sina.com