阴茎海绵神经损伤采用蚕丝蛋白膜联合神经生长因子修复实验研究

庞永冰，王琳琳＊，校晗

(菏泽医学专科学校，山东菏泽274000;*嘉祥县人民医院，山东嘉祥272400）

阴茎海绵神经损伤采用蚕丝蛋白膜联合神经生长因子修复实验研究

庞永冰，王琳琳＊，校晗

(菏泽医学专科学校，山东菏泽274000;*嘉祥县人民医院，山东嘉祥272400）

目的探讨阴茎海绵体内损伤结合丝素蛋白膜神经修复神经生长因子的疗效。方法将36只雄性健康SD大鼠随机分成三组，海绵体神经切断组、丝素蛋白膜联合神经生长因子组及丝素蛋白膜修复组。每组12只。海绵体神经切断组大鼠单纯切断双侧的海绵体神经，不做其他处理；对丝素蛋白膜联合神经生长因子F组大鼠先制作海绵体神经缺损的模型，然后用丝素蛋白膜桥接进行修复，局部注入神经生长因子30 μl；丝素蛋白膜修复组仅用丝素蛋白膜对缺损的海绵体神经进行桥接修复；术后90天对三组大鼠进行：阿朴吗啡试验，计数SD大鼠阴茎勃起次数、勃起率。应用免疫组化方法检测大鼠阴茎中后部海绵体组织中神经型一氧化氮合酶的表达。应用SPSS17.0软件，所获数据采用方差分析、t检验和χ2检验。结果阴茎勃起率A组与B组、A组与C组比较，P均＜0.005;B组与C组比较，P＞0.05。勃起次数A组与B组、A组与C组比较，P均＜0.0005;B组与C组比较，P＜0.001。对缺损的海绵体神经断端进行桥接修复后将自制的神经生长因子90天后NOS神经纤维染色最为明显。阳性纤维数目A组与B组、A组与C组、B组与C组数目比较，P均＜0.0005。结论丝素蛋白膜联合神经生长因子对海绵体神经修复与再生具有明显的促进作用，为海绵体神经缺损的临床治疗提供了新的方向及实验依据。

丝素蛋白膜/治疗应用；神经生长因子/治疗应用；海绵体神经损伤/治疗

前列腺癌的发病率在我国逐渐上升，成为男性常见的恶性肿瘤之一，目前对该病最好的治疗方法仍然是前列腺癌根治手术，但在手术过程中，对前列腺的周围神经血管的损伤是不可避免的，其中的海绵体神经被损伤后会导致患者出现勃起功能障碍（ED），使患者术后的生活质量下降。我们应用SD大鼠模拟外科手术对海绵体神经所形成的损伤，然后应用丝素蛋白膜(SF)联合神经生长因子(NGF)对损伤进行修复，在手术后的90天对其修复效果进行评价。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验分组36只健康SD雄性大鼠，体重180～260 g(解放军第八十九医院动物实验中心提供)，随机分为3组，每组12只。A组：海绵体神经切断组；B组：SF联合NGF组；C组：SF修复组。

1.2 实验材料纯度百分之百的丝素蛋白膜，剪成0.5 cm×0.8 cm备用；在牛精液中自行纯化的N G F溶液，每毫升中约神经生长因子约1 mg。

1.3 实验动物处理SD大鼠仰卧固定于实验台，用浓度为2.5%的戊巴比妥钠（北京普博斯生物科技有限公司，P3761）按每公斤体重约40 mg～45 mg行腹腔麻醉。成功以后取下腹部正中切口，依次找到睾丸、精囊腺等组织，将这些盆腔组织进行外翻，在前列腺和直肠前外侧壁间应用外科显微镜（徕卡显微系统上海贸易有限公司，F40）寻找海绵体神经，找到了海绵体神经后进行游离，为证实其为海绵体神经可用自制的电极对该神经进行刺激，证实以后按照实验分组处理。处理方法：A组大鼠先找到海绵体神经，然后将两侧的神经分别切除约8 mm左右，然后缝合切口，不做其它处理；B组大鼠将海绵体神经切除8 mm后，在外科手术显微镜底下用9-0的尼龙线将SF与海绵体神经的两个断端进行桥接修复；C组大鼠双侧海绵体神经被切除8 mm后以SF单纯进行桥接修复。

1.4 实验结果评定指标（1）阿朴吗啡试验：手术后90天，对各组大鼠进行阿朴吗啡试验，具体方法是在大鼠的颈部用自制阿朴吗啡溶液(上海静融生物科技有限公司，100839-200601)以每公斤体重150 μg进行注射，在注射后的30 min内对大鼠阴茎勃起情况进行观察并计数勃起的次数。（2）免疫组化方法：计数神经性一氧化氮合酶神经纤维的数目：手术后90天，取实验大鼠阴茎中后部的海绵体，将所得海绵体组织运用常规方法制成石蜡切片，将石蜡切片脱蜡后进行抗原的修复，修复后在室温下用山羊血清封闭液(北京中杉金桥生物技术有限公司)封闭20 min，然后将封闭液甩掉，加1∶150浓度的一抗(快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物,北京博奥森生物公司)，在4℃条件下过夜后用PBS进行冲洗，冲洗后加1：100的二抗(大鼠NOS1免疫组化试剂盒,北京博奥森生物技术有限公司)，后在室温下进行20 min的孵育，孵育后应用PBS液进行冲洗，冲洗后滴加新配的DAB液，放在显微镜下进行观察，大约10～20 min左右即发生着色，着色后立即进行冲洗，冲洗后用苏木素进行复染，再进行一次脱水后用中性树胶进行封片，最后将切片放在显微镜(BX51型生物光学显微镜及照相系统,日本Olympus公司)下观察被染成棕黄色的神经纤维，并在400×下随机选取6个视野，对视野中阳性的神经性一氧化氮合酶阳性的神经纤维进行计数。

1.5 统计学处理应用SPSS17.0软件，所获数据采用方差分析、t检验和χ2检验。

2 结果

2.1 计数神经型一氧化氮合酶阳性神经纤维的数目见表1。

表1 一氧化氮合酶阳性神经纤维的数目比较（个

表1 一氧化氮合酶阳性神经纤维的数目比较（个

阳性纤维数目A组与B组、A组与C组、B组与C组，数目比较，t=67.008、25.738、8.9101,P均＜0.0005。

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2.2 阿扑吗啡实验A组大鼠在阴茎勃起次数、勃起率上明显低于B组、C组，差别具有显著性，B、C大鼠间的差别也有统计学意义。见表2。

2.3 免疫组化法观察nNOS神经纤维染色结果术后90天，取各只大鼠阴茎海绵体中部海绵体组织进行免疫组织化学染色，nNOS阳性神经纤维被染成棕黄色，其中A组大鼠棕黄色神经纤维数明显低B组和C组，B组亦明显多于C。见图1、图2、图3。

表2 三组阿扑吗啡结果比较

表2 三组阿扑吗啡结果比较

阴茎勃起率A组与B组、A组与C组比较，χ2=20.307、17.142，P＜0.005;B组与C组比较，χ2=0,P＞0.05。勃起次数A组与B组、A组与C组比较，t=8.2272、6.5206，P＜0.0005;B组与C组比较，t=3.6484，P＜0.001。

图1 A组大鼠nNOS神经纤维染色结果

图2 B组大鼠nNOS神经纤维染色结果

图3 C组大鼠nNOS神经纤维染色结果

3 讨论

神经生长因子是在20世纪50年代初被最早发现的神经营养因子，关于它的研究最为清楚，神经生长因子在维持神经系统的发育以及神经系统功能方面起着非常重要的作用。有研究表明[1]，神经生长因子在周围神经的再生过程中起着重要的作用，其与神经再生的关系非常密切，在周围神经损伤缺损处局部给予外源性神经生长因子，经过一系列的作用后最终会引起神经的功能、生理的变化[2]。当周围神经发生损伤后，该神经的神经元将发生死亡等一系列的病理生理改变[3]，在神经损伤处给于外源性的神经生长因子，不仅可以保护神经元，防止神经元死亡，而且还可以促进突起的生长。损伤金鱼的视神经，后在神经损伤局部给予外源性的神经生长因子，发现损伤的视神经的神经纤维在数量、长度上明显增加，表明该因子具有促进神经纤维再生的作用，而且可以促进神经功能的恢复[4]。

丝素蛋白膜是一种纯天然的高分子生物蛋白，它主要有丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸组成，其有较好的化学、物理性能，而且具有良好的人体亲和性[5]、生物相容性[6]、在体内可以发生生物降解[7]。近十几年来国内外对丝素蛋白膜在人工血管[8]、药物载体[9]、人工皮肤[10]、骨组织修复[11]，尿道修复[12]等方面进行了广泛的研究，并获得可观的结果。在神经组织工程运用方面，国内外都有大量研究，在面神经的缺损上首先应用了丝素蛋白膜导管对缺损进行了修复，修复效果比较理想[13]。我们也曾运用丝素蛋白膜对大鼠的海绵体神经缺损进行修复的实验研究，取得满意结果。故丝素蛋白膜、神经生长因子在周围神经损伤的修复上都有着一定的作用，本实验应用丝素蛋白膜联合神经生长因子对大鼠的海绵体神经缺损进行了修复，结果表明丝素蛋白膜联合神经生长因子对大鼠海绵体神经的修复、再生具有明显的促进作用，这为临床上周围神经的损伤修复提供新的治疗方法和实验依据。

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Sponge Nerve Injury Using Fibroin Membrane Joint Repair Nerve Growth Factor Experiments

Pang Yongbing,Wang Linlin⋆，Xiao Han
(Heze Medical College,Heze 274000,Shandong；*People's Hospital of Jiaxiang,Jiaxiang 272400,Shandong)

ObjectiveTo discuss Inside the penis sponge body damage combined with silk fibroin membrane the curative effect of nerve repair nerve growth factor.Methods36 healthy male SD rats were randomly divided into three groups,cavernous nerve cut group,the silk fibroin membrane joint nerve growth factor and silk fibroin membrane repair group.12 in each group.Cavernous nerve to cut off the set of simple cut bilateral cavernous nerve of rats,don't do other processing.Of silk fibroin membrane joint nerve growth factor group F rat cavernous nerve defect model,first and then use silk fibroin membrane bridge repair,30 μL local injection of nerve growth factor.Silk fibroin membrane repair group only with silk fibroin membrane for bridge repair the defect of the cavernous nerve.After 90 days on three groups of rats：apomorphine test,counting rate of SD rats penile erectile times,erectile.In the application of immunohistochemical method to detect the rat penis sponge tissue at the back of the nerves in the expression of nitric oxide synthase.The obtained data analyzed by variance,ttest andχ2test with the SPSS17.0 software.ResultsThe rate of penile erectile group A and group B, group A compared with group C,P＜0.005.Group B compared with group C,P＞0.05.Erectile times in group A and group B,group A compared with group C,P＜0.0005.Group B compared with group C,P＜0.001.To bridge the defect cavernous nerve end after repair will be homemade nerve growth factor 90 days NOS nerve fiber dyeing is most obvious.Number of positive fibers in group A and group B,group A and group C,group B compared with group C number,P＜0.0005.Con-clusionSilk fibroin membrane joint nerve growth factor of cavernous nerve repair and regeneration has an obvious role in promoting,for cavernous nerve defects and provides a new direction and experimental basis for clinical treatment.

Silk fibroin membrane/therapeutic use；Nerve growth factor/therapeutic use；Cavernous nerve injury/ therapy

R697.5

A

1008-4118（2017）01-0001-04

10.3969/j.issn.1008-4118.2017.01.001

2016-11-25