苦丁茶冬青多糖乙醇分级纯化及其理化性质研究

赵书凡++朱科学++朱红英++贺书珍++谭乐和

摘 要 為了研究苦丁茶冬青多糖醇沉规律及产物理化性质。通过热水浸提和不同浓度乙醇分级沉淀，得到乙醇终浓度为20%、40%、60%和80%的4种苦丁茶冬青多糖组分，即ICP-1、ICP-2、ICP-3和ICP-4。比色法检测各多糖组分总糖、糖醛酸、蛋白质和总酚含量；高效凝胶渗透色谱法进行相对分子质量的测定；紫外和红外光谱扫描考察各组分的光谱性质。结果表明：ICP-1、ICP-2、ICP-3和ICP-4总糖含量分别为19.21%、34.91%、37.70%和30.21%，糖醛酸含量分别为5.04%、44.90%、24.20%和5.84%；凝胶渗透色谱图表明：ICP-2和ICP-3为高纯度均一组分，分子量为440.440与348.279 ku；4种多糖组分在280 nm处均有吸收峰，说明均为糖蛋白质化合物。红外结果显示，各组分均为吡喃糖环构型。以上结果表明，乙醇分级沉淀的方法可用于分级纯化制备组分均一、纯度较高的苦丁茶冬青多糖组分。

关键词 苦丁茶冬青 ；多糖 ；理化性质 ；光谱性质

中图分类号 TS272 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.04.018

Ethanol Fractionation and Physico-chemical Properties of Soluble

Polysaccharides from Ilex kudingcha C.J. Tseng

ZHAO Shufan1，2） ZHU Kexue2，3） ZHU Hongying2，3） HE Shuzhen2，3） TAN Lehe3）

（1 College of Food Science and Technology of Huazhong Agricultural University，

Wuhan， Hubei 430070；

2 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533；

3 Hainan Provincial Engineering Research Center for Tropical Spice and Beverage Crops，

Wanning， Hainan 571533）

Abstract Ilex kudingcha C.J. Tseng was extracted with hot water and then fractionated with ethanol to produce different concentrations of water-soluble polysaccharides， and the physico-chemical properties of these polysaccharides was analyzed. The polysaccharides were fractionated and purified into fractions with concentrations of 20%， 40%， 60% and 80%， and were named ICP-1， ICP-2， ICP-3 and ICP-4， respectively. The polysaccharides were detected by using colometrics in terms of total sugar， protein， alduronic acid and total phenol； their molecular weight （Mw） was determined by using high performance gel permeation chromatography， and their spectroscopic properties by using UV and IR spectra analysis. The polysaccharides fractions ICP-1， ICP-2， ICP-3 and ICP-4 were detected to contain 19.21%， 34.91%， 37.70% and 30.21% of total sugar， respectively， and their alduronic acid contents were 5.04%， 44.90%， 24.20% and 5.84%， respectively. The gel permeation chromatograph showed that ICP-2 and ICP-3 were of high and uniform purity， their Mw being estimated about 440.440 and 348.279 ku. The UV spectra showed that these four fractions all had a characteristic absorption peak at near 280 nm. The IR spectrum indicated that all the fractions had a structure of pyranose ring. These results showed that this extraction and fractionation method can be used to produce uniformly pure water-soluble polysaccharides with higher concentrations from I. kudingcha C.J. Tseng.

Keywords Ilex kudingcha C.J.Tseng ； polysaccharides ； physicochemical properties ； spectroscopic properties

苦丁茶具有极高的药用和保健价值，在中国消费历史已超过2 000多年[1]，至少涉及12个科30多个不同品种[2-3]，市面上常见的苦丁茶种类以木犀科为代表的小叶苦丁茶及冬青科为代表的大叶苦丁茶为主[4]。苦丁茶富含多酚、黄酮、三萜类、皂苷和多糖等生理活性物质，具有抗氧化、抗衰老、降血脂、降血压和抑菌等多种生理功效[5]。

天然产物多糖广泛存在于自然界中，已有研究结果发现，香菇多糖、灵芝多糖、车前子多糖等生物活性多糖具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗炎症等活性[6-8]。苦丁茶作为中国传统的药食植物资源，其中含有丰富的多糖类化合物。何玲玲等[9]研究发现，苦丁茶冬青多糖为一种复杂的糖蛋白类化合物，Fan等[5]针对大叶冬青多糖的一级结构及其生理功效进行了一系列的探索研究。目前，除了对苦丁茶多糖的生理活性有研究外，关于苦丁茶多糖的提取纯化工艺及理化性质却鲜有报道。

因此，本实验拟以苦丁茶冬青为研究对象，采用乙醇分级沉淀的方法分离得到组分单一且纯度较高的苦丁茶冬青多糖，并测定不同分级组分的总糖含量、糖醛酸含量、蛋白质含量及总酚含量等理化指标，采用凝胶渗透色谱法对其进行纯度鉴定和相对分子质量的测定，同时考察各组分紫外和红外光谱特性，以期为高纯度的苦丁茶冬青多糖的快速分离提供理论依据，为其开发利用奠定一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

苦丁茶冬青，由中国热带农业科学院香料饮料研究所提供。

1.1.2 试剂

考马斯亮蓝G250购自国药集团化学试剂有限公司；牛血清蛋白、半乳糖醛酸、葡萄糖、KBr购自美国Sigma公司；焦性没食子酸购自阿拉丁生化科技股份有限公司；葡聚糖标准品（T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000）、福林酚购自上海荔达生物科技有限公司；苯酚、浓硫酸、叠氮钠为分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、无水乙醚均为分析纯试剂，购自西陇化工股份有限公司。

1.1.3 仪器与设备

ME4002E电子天平，购自梅特勒-托利多有限公司；DK-98-1型电热恒温水浴锅，购自天津泰斯特仪器有限公司；R-215旋转蒸发仪，购自瑞士步琪实验设备公司；LXJ-IIB多管离心机，购自上海安亭科学仪器厂；Scientz-18ND真空冷冻干燥机，购自宁波新芝生物科技股份有限公司；SPECORD 250 PLUS紫外可见分光光度计，购自德国耶拿分析仪器公司；Nicolet FT-IR 5700傅立叶红外光谱仪，购自赛默飞世尔科技公司；Waters2695超高效凝胶渗透色谱仪，购自美国Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 苦丁茶冬青多糖的提取

取苦丁茶冬青干叶，用粉碎机磨成粉状，然后用85%的乙醇溶液浸提24 h，过滤，滤渣于50℃烘箱中烘干备用。称取一定量的苦丁茶干燥粉末，与蒸馏水按1∶20于80℃条件水浴3 h，重复2次，合并收集滤液，旋转蒸发进行浓缩。浓缩液经Sevage试剂（氯仿∶正丁醇为4∶1，V/V）除蛋白，重复3次，透析（自来水48 h，蒸馏水24 h）。

收集透析液，旋轉蒸发浓缩至适当的体积，加入无水乙醇，调节乙醇溶液终浓度分别为20%、40%、60%、80%，4℃冰箱中放置12 h，4 000 r/min离心10 min，分别收集对应乙醇浓度下的沉淀物质，真空冷冻干燥至恒重，得到4种不同组分的苦丁茶冬青多糖ICP-1、ICP-2、ICP-3、ICP-4。

1.2.2 理化指标测定

以葡萄糖为标准，采用苯酚-硫酸法测定总糖含量（w/w）；以半乳糖醛酸为标准，采用硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量（w/w）；以牛血清蛋白为标准，采用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量（w/w）；以焦性没食子酸为标准，采用福林酚法测定总酚含量（w/w）。

1.2.3 多糖纯度及相对分子质量的测定

多糖的相对分子质量大小与其在凝胶柱上的洗脱体积具有一定的线性关系，通过绘制不同相对分子质量葡聚糖标准品的标准曲线，根据相同条件下多糖样品的洗脱体积，对照标准曲线即可测定苦丁茶冬青多糖的相对分子质量。

标准品溶液：蒸馏水配置1 mg/mL的葡萄糖、Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70、Dextran T-500、Dextran T-2000溶液。

样品溶液：蒸馏水配成质量浓度为1 mg/mL的ICP-1、ICP-2、ICP-3、ICP-4溶液。

采用UltrahydrogelTM Linear Column （7.8 mm×300 mm）色谱柱，以0.02%（w/w）叠氮钠水溶液为流动相，示差检测器温度为40℃，流速为0.6 mL/min。样品进样前用0.45 μm的膜过滤，进样量为10 μL。

1.2.4 紫外可见光谱分析

蒸馏水配成质量浓度为0.1 mg/mL的样品溶液，紫外-可见分光光度计扫描并采集ICP-1、ICP-2、ICP-3、ICP-4溶液在190～900 nm波段范围内的图谱信息。

1.2.5 红外光谱分析

分别称取苦丁茶冬青各组分多糖ICP-1、ICP-2、ICP-3、ICP-4各1～2 mg，与光谱级溴化钾混合研磨成细小颗粒，压制成透明薄片，在波数为400～4 000 cm-1范围内扫描其红外光谱图。

2 结果与分析

2.1 理化性质测定

由图1可知，苯酚-硫酸法测定总糖含量的回归方程为y=12.254x+0.010 1，R2=0.999 8；硫酸-咔唑法测定半乳糖醛酸含量的回归方程为y=6.922 7x+0.018 9，R2=0.998 0；考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的回归方程为y=7.021 4x+0.005 97，R2=0.996 2；福林酚法测定总酚含量的回归方程为y=37.980x+0.015 4，R2=0.999 6。

由表1可知，ICP-1、ICP-2、ICP-3和ICP-4的总糖含量分别为19.21%、34.91%、37.70%和30.21%，其中乙醇浓度在40%和60%时，总糖浓度高于其他组分。ICP-1、ICP-2、ICP-3和ICP-4的糖醛酸含量分别为5.04%、44.90%、24.20%和5.84%，推断苦丁茶冬青多糖可能为酸性多糖。ICP-1、ICP-2、ICP-3和ICP-4组分中的总酚含量较少，表明通过乙醇分级沉淀的方式能有效降低苦丁茶冬青多糖组分里的杂质含量，达到初步纯化、分离的目的。经过sevag法重复脱除蛋白质之后，ICP-1、ICP-2、ICP-3和ICP-4四组分仍均含有较少的蛋白质，推测苦丁茶冬青多糖可能是一种复杂的糖蛋白类物质。从表1中各理化指标的检测结果中可以得出，ICP-2和ICP-3组分的多糖纯度较高，其总糖、糖醛酸和蛋白质三者含量之和分别为87.59%与66.01%，具有较高的研究价值。

2.2 纯度及相对分子质量测定

从图2可看出，ICP-2与ICP-3组分为均匀对称单峰，说明乙醇浓度在40%和60%浓度条件下沉淀所得的苦丁茶冬青多糖纯度较高。而ICP-1和ICP-4组分的凝胶渗透色谱图则显示含有多个峰形，说明存在不同相对分子质量的苦丁茶冬青多糖组分。与表1的理化性质检测结果相对应，ICP-1中含有较多的杂质可能为其出现多个色谱峰的主要原因。

对比4个不同分离组分的凝胶渗透色谱图可发现，不同乙醇浓度得到的组分的保留时间有明显的后移趋势，说明采用乙醇分级的方法能达到将不同相对分子质量的苦丁茶冬青多糖分离、纯化的目的。

按1.2.3中的色谱条件进样，分别记录各葡聚糖系列标准品的相对保留时间tR，并计算其分配系数Kav值（表2）。根据分子量和分配系数Kav值绘制凝胶渗透色谱葡聚糖系列标准曲线，得到标准曲线方程Kav=-0.255 2logMw+1.539 7，R2=0.981 4（图3）。

根据图2中ICP-2与ICP-3的凝胶渗透色谱图的相对保留时间12.880和13.010 min，计算得出ICP-2与ICP-3组分的苦丁茶冬青多糖的相对分子质量约为440.44与348.279 ku。

2.3 紫外可见光谱分析

由图4可知，ICP-1、ICP-2、ICP-3和ICP-4组分在280 nm处均有吸收峰，说明均有蛋白质的存在，且ICP-1中蛋白质的含量最高，这与表1所列理化性质的检测结果相一致。从图4可看出，与ICP-1和ICP-4相比，ICP-2和ICP-3的紫外扫描图谱显得更为平滑，说明其中杂质相对较少。结合图2中4种多糖的凝胶渗透色谱图可看出，ICP-2与ICP-3是纯度相对比较高的苦丁茶冬青多糖组分。

2.4 红外光谱分析

由图5可知，ICP-1、ICP-2、ICP-3和ICP-4这4个组分的主要吸收谱带基本相同，说明不同分级组分具有相同的官能团，其分子结构基本相同。其中3 400～3 300 cm-1出现宽且强的吸收峰應为糖类结构中O-H伸缩振动产生的，2 930 cm-1处应该为C-H的伸缩振动所形成的吸收峰，1 400～1 200 cm-1的吸收谱带可能为糖类结构中C-H的变角振动所产生，由以上3点可初步判定这4个组分的主要组分均为多糖类化合物。

红外图谱中1 738～1 640 cm-1之间的吸收峰推测为-COOH中-C=O的吸收峰，1 250～1 230 cm-1出现的吸收峰推测为-COOH中O-H的变角振动所形成。同时，3 400～3 300 cm-1范围内存在O-H的伸缩振动，判断ICP-1、ICP-2、ICP-3和ICP-4这4个组分含有-COOH和-CHO这2种官能团，表明所得到的多糖组分均含有糖醛酸，与前面理化性质结果一致。

此外，红外谱图中1 602 cm-1附近及1 530～1 510 cm-1范围内的一组弱吸收峰应为酰胺结构中N-H的弯曲振动产生，1 440 cm-1附近存在N-H变角振动产生的振动吸收，1 110～1 070 cm-1附近产生的强而尖的吸收峰推测为C-N伸缩振动所产生，由此可判断ICP-1、ICP-2、ICP-3和ICP-4组分中均含有蛋白质，与理化指标的检测结果及紫外扫描的图谱信息一致（图5）。

1 020～980 cm-1范围内出现的弱吸收峰应为吡喃型糖苷的特征吸收。920～890 cm-1范围内的弱吸收峰为β-吡喃糖环的非对称伸缩振动所产生，850～810 cm-1范围所产的弱吸收则为α-吡喃糖环的特征吸收，由此说明苦丁茶冬青多糖的单糖主要以吡喃型糖环的形式存在。

3 讨论

多糖的纯化对于从天然产物中筛选高效的天然活性多糖组分具有重要的意义。传统热水浸提的方法所得到的多糖大多为糖类的混合物[10]，其差异性主要表现在不同组分之间的理化性质、化学组成和微观结构的不同。天然产物多糖的抗氧化[11]、抗肿瘤[12]及促免疫调节[13]的功能与其复杂的结构组成有着密切联系[14]。Fan等[5]研究结果发现，大叶冬青苦丁茶多糖清除活性氧自由基的能力随糖醛酸含量升高及分子量增加呈明显上升趋势。Miao等[12]研究结果发现，花脸香蘑多糖中糖醛酸含量能显著影响其抗肿瘤的能力，具有更佳的潜在利用价值。本研究利用乙醇分级沉淀的方法从苦丁茶冬青水提物中分离得到纯度较高且组分均一的苦丁茶冬青多糖组分ICP-2与ICP-3，具有更加方便、快捷的优点。

苦丁茶冬青多糖是苦丁茶冬青中一类重要的功能活性组分。王新等[15]利用DEAE-纤维素阴离子交换柱层析法对苦丁茶粗多糖KPSⅡ进行分离纯化，得到2个精制的分离组分KPSⅢa和KPSⅢb，其总糖含量分别为72.31%和67.26%，蛋白质含量分别为2.72%和3.27%。本实验利用苯酚-硫酸法测得ICP-1、ICP-2、ICP-3和ICP-4中总糖含量分别为19.21%、34.91%、37.70%和30.21%；利用硫酸-咔唑比色法测得糖醛酸含量分别为5.04%、44.90%、24.20%和5.84%，其中，ICP-2和ICP-3的糖含量较高，且经过sevag法脱除蛋白处理后仍含有少量的蛋白质，这表明苦丁茶冬青多糖可能是一类与蛋白质紧密结合的糖蛋白类聚合物，该结果与何玲玲等[9]、王新等[15]、吴晓鹏等[16]报道的研究结果一致。苦丁茶冬青多糖ICP-1、ICP-2、ICP-3和ICP-4的紫外可见分光广度计扫描图谱中260、280、330 nm处均存在吸收峰，说明含有一定量的蛋白质、核酸和多酚等成分，其中ICP-2和ICP-3为纯度相对较高的乙醇分级组分。

蔡娟等[17]研究结果发现，苦丁茶冬青粗多糖在1 520（N-H弯曲振动）、1 450（N-H变角振动）和1 080 cm-1（C-N伸缩振动）附近存在较强的吸收峰，这可说明苦丁茶冬青多糖中存在紧密结合的蛋白质。本研究结果表明，苦丁茶冬青多糖ICP-1、ICP-2、ICP-3和ICP-4均为含有蛋白质的酸性多糖，其单糖构型主要以吡喃型糖环为主，与前期报道的 研究结果一致。Xu等[18]通过HP-GPC测得浒苔多糖PHPE1、PHPE2、PHPE3的相对分子质量分别为103、45.4、9.8 ku。殷军艺等[19]利用HPGPC对运用生物大分子纯化系统的大粒车前子分离组分PLP进行纯度及分子量的测定，其研究结果表明，PLP为均一多糖，相对分子量约为891.3 ku。本研究利用高效凝胶渗透色谱法（HP-GPC）对苦丁茶冬青多糖4种分级组分的纯度及其相对分子质量进行了研究，结果显示，ICP-2与ICP-3的HP-GPC图谱为对称的单峰，说明这2个组分为纯度较高的苦丁茶冬青多糖，相对分子质量分别为440.440与348.279 ku。与同类研究比较发现，乙醇分级沉淀作为一种简单经济的分离手段，适用于制备组分均一的苦丁茶冬青多糖，能有效简化其分离纯化的工艺，并为其生产应用提供一定的理论支撑。

综上所述，本研究利用乙醇分级沉淀的方法来分离、纯化苦丁茶冬青多糖，并对各组分进行理化性质分析。结果表明，乙醇浓度40%、60%和80%分离得到的ICP-2、ICP-3和ICP-4的总糖含量较高，且均含有一定量的蛋白质，其中ICP-2与ICP-3这2个组分的糖醛酸含量较高，各苦丁茶冬青多糖组分主要以吡喃型糖环的形式存在。其中，ICP-2与ICP-3为均一的苦丁茶冬青多糖组分，其相对分子质量分别为440.44与348.279 ku。因此，乙醇分级沉淀的方法可用于分级纯化制备组分均一、纯度较高的苦丁茶冬青多糖组分。

参考文献

[1] Yang B， Yang T， Tan Q， et al. Antiplatelet aggregation triterpene saponins from the leaves of Ilex kudingcha[J]. Phytochemistry Letters， 2015， 13（2）： 302-307.

[2] Zhu F，Cai Y Z，Sun M，et al. Comparison of major phenolic constituents and in vitro antioxidant activity of diverse Kudingcha genotypes from Ilex kudingcha， Ilex cornuta， and Ligustrum robustum[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2009， 57（14）： 6 082-6 089.

[3] 谷 婧，彭 勇，许利嘉，等. 苦丁茶商品的原植物调查与性状鉴别[J]. 中药材，2011，34（2）：196-199.

[4] 徐小静，郭志永，刘 越. 苦丁茶植物资源及分子鉴定研究进展[J]. 中央民族大学学报（自然科学版），2012，21（3）：22-28.

[5] Fan J， Wu Z， Zhao T， et al. Characterization， antioxidant and hepatoprotective activities of polysaccharides from Ilex latifolia Thunb[J]. Carbohydrate Polymers， 2014， 101（1）： 990-997.

[6] 謝红旗. 香菇多糖提取、纯化、结构表征及生物活性的研究[D]. 长沙：中南大学，2007.

[7] 殷军艺. 大粒车前子多糖生物活性、结构和构象特征研究及多糖分离纯化新方法初探[D]. 南昌：南昌大学，2012.

[8] Nie S， Zhang H， Li W， et al. Current development of polysaccharides from Ganoderma：Isolation，structure and bioactivities[J]. Bioactive Carbohydrates & Dietary Fibre， 2013， 1（1）： 10-20.

[9] 何玲玲，王 新. 苦丁茶冬青叶多糖的提取与鉴定[J]. 沈阳化工大学学报，2006，20（1）：12-15.

[10] 周 超. 车前子多糖的分离纯化及其功能性质研究[D]. 南昌：南昌大学，2007.

[11] 王 新. 苦丁茶冬青叶水溶性多糖的分离纯化及抗氧化活性研究[D]. 广州：中山大学，2005.

[12] Miao S， Mao X， Pei R， et al. Antitumor activity of polysaccharides from Lepista sordida against laryngocarcinoma in vitro and in vivo[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2013 60（6）： 235-240.

[13] Wang J， Ge B， Li Z， et al. Structural analysis and immunoregulation activity comparison of five polysaccharides from Angelica sinensis[J]. Carbohydrate Polymers， 2016， 140（1）： 6-12.

[14] 謝明勇，聂少平. 天然产物活性多糖结构与功能研究进展[J]. 中国食品学报，2010，10（2）：1-11.

[15] 王 新，何玲玲，刘 彬. 苦丁茶冬青叶多糖的分离纯化及其对羟自由基的清除作用[J]. 食品科学，2008，29（6）：37-40.

[16] 吴晓鹏，王一飞，刘秋英，等. 苦丁茶多糖的提取分离纯化及部分理化性质研究[J]. 食品与发酵工业，2007，33（6）：141-144.

[17] 蔡 鹃，黄敏桃，黄云峰，等. 苦丁茶多糖活性成分动态累积及其抑菌活性[J]. 食品科学，2014，35（9）：43-47.

[18] Xu J， Xu L L， Zhou Q W， et al. Isolation，purification，and antioxidant activities of degraded polysaccharides from Enteromorpha prolifera[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2015， 81（7）： 535-542.

[19] 殷军艺，聂少平，付志红，等. 大粒车前子多糖分离、纯化及单糖组成分析[J]. 食品科学，2008，29（9）：529-532.