HPLC测定星油藤饼和蛋白中桑色素、橙皮素、柚皮素和单宁的含量

夏克东，刘斯博，李林芽，田少君

(河南工业大学粮油食品学院, 郑州 450001)

检测分析

HPLC测定星油藤饼和蛋白中桑色素、橙皮素、柚皮素和单宁的含量

夏克东，刘斯博，李林芽，田少君

(河南工业大学粮油食品学院, 郑州 450001)

采用HPLC测定星油藤饼和蛋白中桑色素、柚皮素、橙皮素和单宁的含量。通过对柚皮素和单宁在星油藤饼和蛋白中含量的考察以及Dot值分析，探究单宁和柚皮素对不愉快风味贡献的程度。结果表明：橙皮素、柚皮素、桑色素、单宁分别在0.787～39.344、0.937～46.884、0.997～49.828、1.200～60.010 μg/mL范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系；橙皮素、柚皮素、桑色素和单宁的检测限分别为1.56、0.86、2.68、3.56 μg/mL；星油藤浓缩蛋白中桑色素、橙皮素、柚皮素和单宁的含量比星油藤饼中分别减少了4 258、2 929、1 720、2 602 mg/kg；单宁和柚皮素分别对星油藤饼涩味和苦味贡献显著，醇洗分离法可以有效脱除星油藤饼中的不愉快风味。

星油藤；HPLC；桑色素；橙皮素；柚皮素；单宁

星油藤又称为南美油藤、印加果、印奇果，大戟科，木质藤本作物，是一种新型特种油料作物。星油藤果实脂肪含量高、蛋白质含量高，自2006年星油藤由中国科学院西双版纳热带植物园引种成功以来，我国科学家对星油藤的研究开始予以关注，但是目前对于星油藤蛋白的研究较少。星油藤种子蛋白质含量仅次于大豆，远高于花生仁、核桃等坚果；而其脂肪含量仅次于核桃和松子，与葵花籽、亚麻籽和花生仁相当[1-3]；另外其还含有维生素、甾醇等生物活性物质和生物碱、香豆素、皂甙和黄酮类物质等[1-6]。有研究用薄层层析色谱在星油藤饼中检出了桑色素、橙皮素等黄酮类物质[6]。橙皮素、桑色素有消炎、抗氧化、降压等生物活性。但是植物蛋白中存在的单宁和一些二氢黄酮类物质也会影响植物蛋白产品的风味[7-9]。植物中的苦涩味成分大多是植物性多酚、黄酮、萜和苷等化合物。据报道，单宁和一些黄酮类物质能够明显引起植物蛋白的苦涩味[10-13]。

本研究采用HPLC检测星油藤饼和蛋白中桑色素、橙皮素、柚皮素和单宁含量上的差异,并通过Dot值分析涩味物质单宁和苦味物质柚皮素对不愉快风味的贡献程度，以期为星油藤蛋白产品的开发利用和品质监控提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

星油藤饼；星油藤分离蛋白(PPI，以饼为原料，碱溶酸沉法实验室自制)；星油藤浓缩蛋白(PPC，以饼为原料，醇洗分离法实验室自制)；单宁标准品(CAS号：1401-55-4)、橙皮素标准品(CAS号：520-33-2)、柚皮素标准品(CAS号：480-41-1)、桑色素标准品(654055-01-3)，纯度≥98%，均购于北京盈泽纳新化工技术研究院；色谱纯甲醇、乙腈；磷酸氢二钾；超纯水，自制。

SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵；KQ5200DE 超声波清洗器；雷磁PHS-3C精密pH计； Waters2695高效液相色谱仪(Waters 2998PDA检测器；WAT054275 Waters C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm))；Agilent1260高效液相色谱仪(G1315 1260DAD检测器；Agilent 20R13Ax sb-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm))。

1.2 实验方法

1.2.1 标准品溶液的配制

(1)精确称取标准品柚皮素11.721 1 mg、桑色素12.457 2 mg、橙皮素9.836 1 mg，用甲醇定容至250 mL，配成混合标准品储备液，质量浓度依次为46.884、49.828、39.344 μg/mL。

(2)精确称取单宁标准品6.001 0 mg，用甲醇定容至100 mL，配制成单宁标准品储备液，质量浓度为60.010 μg/mL。

1.2.2 测定方法

采用液相色谱法测定桑色素、柚皮素、橙皮素的含量。PDA检测器，检测波长324 nm；流动相A为乙腈，B为30 mmol/L pH 2.5的磷酸盐缓冲液；梯度洗脱：0～7 min，100% A～65% A；7～20 min，65% A～35%A；柱温30℃；流速0.5 mL/min；进样量10 μL。

采用液相色谱法测定单宁的含量[14]。DAD检测器，检测波长275 nm；流动相为甲醇-水(体积比80∶20)；流速0.5 mL/min；柱温25℃；进样量10 μL。

1.2.3 线性关系和线性范围的考察

分别取混合标准品储备液和单宁标准品储备液0.2、2、4、6、8、10 mL置于10 mL容量瓶，用甲醇稀释至刻度，得到一系列质量浓度的标准品溶液，每个质量浓度进样3 次，以峰面积平均值(Y)为纵坐标，质量浓度(X)为横坐标，进行回归分析。

1.2.4 样品测定

分别精确称取星油藤分离蛋白1.012 5 g、星油藤浓缩蛋白1.338 0 g、星油藤饼1.097 1 g， 置于250 mL圆底烧瓶中，精密加入200 mL甲醇，称重，水浴加热冷凝回流提取60 min，冷却，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，用0.22 μm有机微孔滤膜过滤，按1.2.2方法进样分析。用外标法计算各物质含量，每个样品重复3次。

2 结果与分析

2.1 样品的HPLC谱图

以乙腈-磷酸盐缓冲液为流动相，流速为0.5 mL/min，可快速有效分离桑色素、柚皮素和橙皮素。图1为星油藤饼、星油藤蛋白中桑色素、橙皮素、柚皮素的HPLC谱图。图2为星油藤饼和星油藤蛋白中单宁的HPLC谱图。

注：a.星油藤饼；b.PPI；c.PPC。

图2 星油藤饼和蛋白中单宁的HPLC谱图

桑色素、橙皮素和柚皮素的水溶液呈酸性，碱性条件易被氧化，酸性条件不仅能防止拖尾改善峰形，还能抑制其水解和氧化褐变，结果证明目标成分对磷酸选择性良好，目标成分可以得到良好的分离，且杂峰很少。

2.2 分析方法考察

2.2.1 线性关系、线性范围和检测限

当信噪比为3时所得到的质量浓度为检测限，信噪比为10时所得到的质量浓度为定量限。柚皮素、桑色素、橙皮素和单宁的线性方程、相关系数、线性范围检测限和定量限如表1所示。

表1 标准曲线和检测限(n=6)

从表1可知，桑色素、橙皮素、柚皮素和单宁在相应的线性范围内其质量浓度与峰面积呈现出良好的线性关系，相关系数均大于0.999。橙皮素、柚皮素、桑色素和单宁的检测限分别为1.56、0.86、2.68、3.56 μg/mL。

2.2.2 精密度实验

取柚皮素、桑色素、橙皮素、单宁标准品储备液按1.2.2方法进样测定，分别在同一天连续进样5次进行日内精密度实验和连续5 d 每天5次测定进行日间精密度实验，计算各待测物峰面积的相对标准偏差(RSD)。结果表明：桑色素、橙皮素、柚皮素、单宁的日内RSD分别为 0.89%、0.97%、1.3%、1.3%，日间RSD分别为1.8%、1.9%、2.0%、3.1%，表明仪器稳定，精密性良好。

2.2.3 重复性实验

精密称取星油藤饼、星油藤分离蛋白、星油藤浓缩蛋白各4份，每份0.1 g，按照1.2.4方法制备样品溶液，按照1.2.2方法进样分析，测定峰面积，计算含量。测得星油藤饼中桑色素、橙皮素、柚皮素和单宁含量的RSD分别为1.5%、1.9%、2.3%、2.7%；星油藤分离蛋白中桑色素、橙皮素和单宁含量的RSD分别为2.5%、2.1%、1.7%；星油藤浓缩蛋白中桑色素、橙皮素、柚皮素和单宁含量的RSD分别为3.1%、2.7%、1.9%、1.5%。表明该方法重复性良好。

2.2.4 稳定性实验

取 1.2.4方法制备的样品溶液，分别在室温放置0、4、8、12、24、48 h后进样，测得星油藤饼中桑色素、橙皮素、柚皮素、单宁峰面积的RSD分别为2.32%、0.88%、2.14%和1.41%；星油藤分离蛋白桑色素、橙皮素和单宁峰面积的RSD分别为0.96%、1.55%、2.38%；星油藤浓缩蛋白桑色素、橙皮素、柚皮素和单宁峰面积的RSD分别为2.67%、3.19%、0.98%、1.58%。表明样品溶液在48 h内稳定。

2.2.5 回收率实验

精密称取星油藤饼、星油藤分离蛋白、星油藤浓缩蛋白各9份，每份0.1 g，分别加入低、中、高3个水平的标准品混合溶液，每个水平3份，按照1.2.4方法制备样品溶液，按照1.2.2方法进行测定，计算加标回收率，结果见表2。

表2 星油藤分离蛋白、浓缩蛋白和饼中4种物质的加标回收率(n=3)

续表2

物质星油藤饼本底值/mg添加量/mg回收率/%RSD/%PPI本底值/mg添加量/mg回收率/%RSD/%PPC本底值/mg添加量/mg回收率/%RSD/%桑色素0.43890.75420.43850.235699.77100.0599.931.81.72.10.15040.45290.35540.2818100.0497.9390.481.81.72.10.01290.01860.01290.006895.87101.1696.451.81.72.1单宁0.32180.63150.32140.121993.3095.7589.272.31.71.60.11070.36270.19120.059893.7698.63100.042.31.71.60.06180.10250.06240.025793.8991.0297.932.21.51.6

从表2可知，加标回收率为89.27%～106.90%，RSD为1.2%～2.3%。

2.3 样品测定

分别精密称取0.1 g星油藤饼、星油藤分离蛋白、星油藤浓缩蛋白，按1.2.4方法制备样品溶液，采用1.2.2方法测定其中的桑色素、橙皮素、柚皮素和单宁的含量，结果见表3。

表3 样品中桑色素、橙皮素、柚皮素和单宁的含量(n=3)

从表3可知，星油藤饼中桑色素、橙皮素、柚皮素和单宁含量分别为4 387、3 215、1 843、3 214 mg/kg；星油藤分离蛋白中柚皮素未检出，桑色素、橙皮素和单宁含量分别为1 508、435、1 107 mg/kg；星油藤浓缩蛋白中桑色素、橙皮素、柚皮素和单宁含量分别为129、286、123、612 mg/kg。在碱溶酸沉法制备分离蛋白过程中，由于溶剂及其他作用使得桑色素、橙皮素和柚皮素保留量很少，但是单宁仍有较多保留。醇洗分离法得到浓缩蛋白中各物质含量均较低，不愉快风味消失。

2.4 滋味物质贡献度

Dot值是指某一滋味成分含量与其滋味阈值的比值。Dot值大小反映了该成分对滋味的贡献度。当Dot值大于1时，则表明该成分对滋味有显著贡献，Dot值越大其滋味贡献度越高。本研究中滋味成分的阈值以及Dot值的计算方法参考Scharbert等[15]的方法。柚皮素和单宁的Dot值分析见表4。

表4 柚皮素和单宁的Dot值分析

从表4可知，星油藤饼和星油藤分离蛋白中单宁对涩味贡献显著；柚皮素对星油藤饼苦味贡献显著。

3 结 论

建立了液相色谱法测定星油藤饼与蛋白中桑色素、橙皮素、柚皮素和单宁的含量。橙皮素、柚皮素、桑色素、单宁分别在0.787～39.344、0.937～46.884、0.997～49.828、1.200～60.010 μg/mL范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系。橙皮素、柚皮素、桑色素和单宁的检测限分别为1.56、0.86、2.68、3.56 μg/mL。星油藤浓缩蛋白中桑色素、橙皮素、柚皮素和单宁的含量比星油藤饼中分别少了4 258、2 929、1 720、2 602 mg/kg，不愉快风味消失。实验发现柚皮素和单宁分别是星油藤饼中苦味和涩味物质的主要来源。醇洗分离法可以有效脱除星油藤饼中的不愉快风味；而在碱溶酸沉法制备星油藤分离蛋白的过程中滋味物质不能得到有效的去除。

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Determination of morin, hesperitin, naringenin and tannins inPlukenetiavolubilis L. cake and protein by HPLC

XIA Kedong, LIU Sibo, LI Linya, TIAN Shaojun

(College of Food Science and Technology, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China)

The contents of morin, naringenin, hesperitin and tannins inPlukenetiavolubilisL. cake and protein were determined by HPLC. The contributing of naringenin and tannins to the unpleasant flavor were researched by studying the contents and dose-over-threshold of those two constituents. The results showed that the linear ranges for hesperitin, naringenin, morin and tannins were 0.787-39.344, 0.937-46.884, 0.997-49.828, 1.200-60.010 μg/mL, respectively. The limit of detection of hesperitin, naringenin, morin and tannins were 1.56, 0.86, 2.68, 3.56 μg/mL, respectively. Compared withpluckenetiavolubilisL. cake, the contents of morin, hesperitin, naringenin and tannins inPlukenetiavolubilisL. protein concentrate reduced by 4 258, 2 929, 1 720, 2 602 mg/kg respectively. Tannins and naringenin contributed more to astringency and bitter taste ofPlukenetiavolubilisL. cake. Ethanol washing separation could remove the unpleasant flavor ofPlukenetiavolubilisL. cake.

Plukenetiavolubilis L.; HPLC; morin; hesperitin; naringenin; tannins

2016-06-15;

2016-12-11

河南省高校科技创新团队支持计划(13IRTSTHN028)

夏克东(1988)，男，硕士研究生，研究方向为粮食、油脂与植物蛋白工程(E-mail)xkd0903@163.com。

田少君，教授(E-mail)shaojun_tian@haut.edu.cn。

TS229;Q58

A

1003-7969(2017)03-0131-05