响应面法优化超声波辅助提取沙棘籽粕中黄酮工艺

张海容，史振华

(1.忻州师范学院 生化所，山西 忻州 034000； 2.材料与计算化学山西省高等学校重点实验室，山西 忻州 034000)

综合利用

响应面法优化超声波辅助提取沙棘籽粕中黄酮工艺

张海容1，2，史振华1

(1.忻州师范学院 生化所，山西 忻州 034000； 2.材料与计算化学山西省高等学校重点实验室，山西 忻州 034000)

研究了沙棘籽粕中黄酮的超声波辅助提取工艺。在单因素实验的基础上，采用响应面分析法对影响黄酮得率的超声功率、提取时间、液料比、提取温度、乙醇体积分数进行优化，建立了二次多项式回归方程的预测模型。结果表明：超声波辅助提取沙棘籽粕中黄酮的最佳工艺条件为超声功率60 W、提取时间20 min、液料比30∶1、提取温度54℃、乙醇体积分数59%、提取次数2次，在最佳工艺条件下黄酮得率为7.11%，与模型理论值7.08%基本一致。

沙棘黄酮；超声波辅助提取；响应面法

沙棘为胡颓子科沙棘属，多年生落叶灌木或乔木，含有丰富而复杂的天然活性成分[1-2]。每年有大量的沙棘籽被榨油，提油之后的沙棘籽粕多数用于牲畜饲料或被丢弃，而含有丰富黄酮类化合物的沙棘籽粕不仅污染环境，而且造成了沙棘黄酮资源的极大浪费。据文献报道[3-6]，沙棘籽粕中含有蛋白质、糖类化合物、脂肪类物质、植物碱和黄酮类物质等多种生理活性成分。沙棘黄酮具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和抗菌、抗病毒及增强免疫等多种生理功效[7]，开发和提取沙棘籽粕中丰富的黄酮类化合物意义重大。

黄酮类物质的提取方法主要有浸提法[8]、索氏提取法[9]、微波提取法[10-11]，少数报道超声提取黄酮[12]等，并通过单因素实验确定最佳提取条件。然而单因素实验无法考虑不同影响因素之间的相互作用对响应值的影响，更无法预测最优实验条件下黄酮的最大得率[13-14]。在单因素实验的基础上，本文采用响应面分析法，对沙棘籽粕中黄酮的超声波辅助提取工艺条件如超声功率、提取时间、液料比、提取温度等因素实现不同参数的优化组合，建立了超声波辅助提取沙棘籽粕中黄酮二次多项式回归模型，为沙棘籽粕中黄酮资源更好地开发利用提供理论指导和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

沙棘籽粕，购自山西省岢岚县酸溜溜饮料厂。芦丁标准品，北京化学试剂公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、95%乙醇、无水乙醇，均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

植物粉碎机；722型分光光度计，上海青华科技仪器有限公司；AB204-N型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；KQ-100DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SHZ-D型循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准曲线绘制

准确称取0.100 0 g芦丁标准品，用无水乙醇溶解，定容至100 mL，制成1.0 mg/mL储备液，然后稀释成100g/mL工作液；分别吸取芦丁工作液1、2、3、4 mL和5 mL于10 mL的比色管中，按照1.2.2方法依次加入一定体积NaNO2、Al(NO3)3和NaOH溶液，用80%乙醇定容，静置15 min，以试剂空白作参比，在最大吸收波长510 nm处测其吸光度，并以吸光度A为纵坐标，芦丁质量浓度C(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线，其回归方程为：A=0.008 7C+0.013 9，R2=0.998 3。

1.2.2 沙棘籽粕中黄酮的提取与测定

准确称取沙棘籽粕干粉0.2 g于100 mL三角瓶中，加入一定体积及一定体积分数乙醇溶液为溶剂，超声波提取、离心，取上清液。所有实验重复2次，合并2次提取液，用95%乙醇定容到100 mL容量瓶中。吸取2 mL该溶液于10 mL比色管中，依次加入5% NaNO20.5 mL、10%Al(NO3)30.5 mL，再加入4%的NaOH溶液4 mL，用80%乙醇定容至10 mL，摇匀，静置15 min；在波长510 nm处测定吸光度，按回归方程计算提取液中黄酮质量浓度，并计算黄酮得率。黄酮得率的计算公式如下：

式中：c为沙棘籽粕提取液测得的黄酮质量浓度，μg/mL；E为稀释倍数；F为沙棘籽粕提取液体积，mL；W为沙棘籽粕干粉质量，g。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 超声功率的影响

在提取时间20 min、液料比30∶1、提取温度55℃、乙醇体积分数60%、提取次数2次条件下，不同超声功率对黄酮得率的影响见图1。

图1 超声功率对黄酮得率的影响

由图1可知，超声功率达60 W时，黄酮得率最大；超声功率超过60 W后，黄酮得率略有下降；当超声功率超过80 W时，黄酮得率略有上升，但变化不大。因此，确定提取沙棘籽粕中黄酮的最佳超声功率为60 W。

2.1.2 提取时间的影响

在超声功率60 W、液料比30∶1、提取温度55℃、乙醇体积分数60%、提取次数2次的条件下，不同提取时间对黄酮得率的影响见图2。

图2 提取时间对黄酮得率的影响

由图2可知，当提取时间从10 min延长到20 min，黄酮得率迅速增大。提取时间超过 20 min 后，黄酮得率的总体变化趋势不断下降。因此，确定提取沙棘籽粕中黄酮的最佳提取时间为20 min。

2.1.3 液料比的影响

在超声功率60 W、提取时间20 min、提取温度55℃、乙醇体积分数60%、提取次数2次的条件下，不同液料比对黄酮得率的影响见图3。

由图3可知，黄酮得率随着液料比增大呈现先增大后减少的趋势。当液料比超过30∶1后，黄酮得率随液料比增大不断下降；当液料比超过50∶1时，黄酮得率略有上升，但变化不大。考虑节省提取溶剂，确定提取最佳液料比为30∶1。

图3 液料比对黄酮得率的影响

2.1.4 提取温度的影响

在超声功率60 W、提取时间20 min、液料比30∶1、乙醇体积分数60%、提取次数2次条件下，不同提取温度对黄酮得率的影响见图4。

图4 提取温度对黄酮得率的影响

由图4可知，随着提取温度的增加，黄酮得率呈现先增大后减小的变化趋势。当提取温度达55℃时，黄酮得率最大。超过55℃时，随提取温度增大黄酮得率明显减少，这可能与过高的温度使乙醇溶剂挥发有关。因此，确定提取沙棘籽粕中黄酮的最佳提取温度为55℃。

2.1.5 乙醇体积分数的影响

在超声功率60 W、提取时间20 min、提取温度55℃、液料比30∶1、提取次数2次条件下，不同乙醇体积分数对黄酮得率的影响见图5。

图5 乙醇体积分数对黄酮得率的影响

由图5可知，随着乙醇体积分数增大，黄酮得率呈现先增大后逐渐减小的趋势。当乙醇体积分数为40%～60%，黄酮得率呈现平缓变化，在乙醇体积分数为60%时，黄酮得率最大。这可能与沙棘籽粕中黄酮和提取溶剂的极性有关[15]。因此，确定提取沙棘籽粕中黄酮的最佳乙醇体积分数为60%。

2.2 响应面实验

2.2.1 响应面实验设计

在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken中心组合实验设计原理，采用五因素三水平的响应面分析法，确定超声法辅助提取沙棘籽粕中黄酮的最佳工艺条件。响应面实验设计因素水平及编码见表1。

表1 响应面实验设计因素水平及编码

2.2.2 响应面实验结果

以黄酮得率(Y)为响应值，对超声波辅助提取沙棘籽粕中黄酮的各个影响因素进行响应面分析，响应面实验结果见表2，回归模型显著性及方差分析见表3。

表2 响应面实验结果

续表2

实验号 A B C D EY/%3100-1016.1832001016.2133-1000-16.34341000-16.2435-100016.5436100016.34370-10-106.2538010-106.04390-10106.1540010106.2141000006.8842000007.1143000007.0744000006.8745000007.1146000007.18

表3 回归模型显著性及方差分析

以黄酮得率为响应值(Y)，得到黄酮得率对各影响因素的二次多项式回归模型为：Y=7.04-0.011A-0.005B-0.056C-0.045D+0.017E-0.005AB-0.007 5AC+0.17AD-0.025AE+0.07BC+0.067BD+0.057BE+0.12CD+0.062CE-0.002 5DE-0.25A2-0.17B2-0.44C2-0.53D2-0.35E2。对多元二次回归方程取一阶偏导得零，得到A=-0.037 4，B=-0.032，C=-0.069 7，D=-0.056 2，E=0.016。故最佳超声功率为60 W，提取时间为20 min，液料比为30∶1，提取温度为54℃，乙醇体积分数为59%，提取次数为2次。

由表3可知，本实验所选模型差异极显著(模型的P<0.01)，说明回归方程描述各因子与响应值之间的关系时，其应变量与全体自变量之间的线性关系是显著的，实验方法是可靠的；变异系数(2.41%)较低，说明实验有良好的稳定性；模型失拟项P=0.291 8>0.05，差异不显著；模型的相关系数R2=0.924 0，说明实验值与理论模型有92.40% 是相符的，该模型与实验拟合较好。

由表3还可知，模型一次项不显著，交互项AD差异显著，其余交互项差异不显著；各因素的二次项均差异极显著。通过P值分析可知，各因素的主效应关系为：乙醇体积分数>提取温度>超声功率>提取时间>液料比，表明乙醇体积分数对黄酮得率的主效应明显。

2.2.3 验证实验

在响应面法优化得到的最佳条件下对沙棘籽粕进行超声波辅助提取实验，黄酮得率达7.11%，与理论黄酮得率7.08%基本一致，相对误差0.42%(n=3)。可见，验证值与回归方程理论值相吻合。

2.2.4 超声波辅助提取法与传统浸提法对黄酮得率影响比较

超声波辅助提取法与传统浸提法的提取条件及黄酮得率的对比结果见表4。

表4 超声波辅助提取法与传统浸提法提取沙棘籽粕中

由表4可知，超声波辅助提取沙棘籽粕中的黄酮，其得率优于传统浸提法。可能的原因是超声波能产生强烈空化效应和搅拌作用，从而增加溶剂穿透力，加速黄酮溶出，黄酮得率较高；而传统浸提法很难破坏细胞结构，提取时间较长。因此，超声波辅助提取具有一定的优越性。

3 结 论

(1)采用响应面法优化沙棘籽粕中黄酮的超声波辅助提取工艺，得到最佳工艺条件为：超声功率60 W，液料比30∶1，提取时间20 min，提取温度54℃，乙醇体积分数59%，提取次数2次。在最佳条件下，黄酮得率为7.11%，与理论值(7.08%)的相对误差为0.42%。

(2)本实验采用超声波辅助提取沙棘籽粕中的黄酮，其得率优于传统浸提法，研究结果对沙棘籽粕综合利用和药物开发研究具有一定的参考价值。

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Optimization of ultrasound-assisted extraction of flavonoids from seabuckthorn seed meal by response surface methodology

ZHANG Hairong1，2， SHI Zhenhua1

(1.Laboratory of Biochemical Analysis， Xinzhou Teachers University， Xinzhou 034000， Shanxi， China；2.Higher Education Key Labortory of Materials and Computational Chemistry in Shanxi Province，Xinzhou 034000， Shanxi， China)

The ultrasound-assisted extraction of flavonoids from seabuckthorn seed meal was investigated. Based on single factor experiment， the factors such as ultrasonic power， extraction time， ratio of liquid to material， extraction temperature and volume fraction of ethanol， influencing yield of flavonoids were optimized by response surface methodology， and predictive polynomial quadratic equation model was established. The results showed that the optimal extraction conditions were obtained as follows：ultrasonic power 60 W， extraction time 20 min， ratio of liquid to material 30∶1， extraction temperature 54℃， volume fraction of ethanol 59%， extraction times twice. Under these conditions， the yield of flavonoids reached 7.11%， and it was consistent with model theoretical value of 7.08%.

seabuckthorn flavonoids； ultrasound-assisted extraction； response surface methodology

2016-05-24；

2016-12-09

忻州师范学院重点学科建设项目(xk201402)；忻州师范学院应用化学创新实践基地项目

张海容(1957)，男，教授，博士，研究方向为有机分析(E-mail)hairong1015@163.com。

TS229；Q58

A

1003-7969(2017)03-0117-05