大豆粉末磷脂脱糖条件的研究

殷 茹，彭 珍，潘丽爽，宋莹莹，曹 栋

(江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122)

综合利用

大豆粉末磷脂脱糖条件的研究

殷 茹，彭 珍，潘丽爽，宋莹莹，曹 栋

(江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122)

以大豆粉末磷脂为原料，建立了以乙醇溶液为溶剂的单溶剂体系脱糖方法。考察了脱糖过程中乙醇体积分数、脱糖温度、料液比、脱糖时间、脱糖次数对脱糖率的影响，并通过正交试验对脱糖条件进行优化。最终得到最佳脱糖条件为乙醇体积分数55%、脱糖温度30℃、料液比1∶8、脱糖时间50 min、脱糖次数1次。在最佳条件下，大豆粉末磷脂脱糖率达90.64%。采用HPLC对所得糖类物质进行了鉴定，结果表明其主要是由蔗糖、棉子糖和水苏糖组成，含量分别为11.87%、8.84%、75.16%。这3种糖与大豆低聚糖主要成分一致。

大豆粉末磷脂；单溶剂体系；正交试验；脱糖率

磷脂是一种含有磷酸的脂类物质，是生物膜的重要组成成分，广泛存在于动物、植物和微生物的细胞膜上[1]。磷脂在肉、蛋、奶中含量较高，但商品化磷脂主要来源于大豆[2]。大豆磷脂具有乳化、润湿、分散、速溶等诸多功能且营养价值较高，被广泛应用于食品、饲料、医药、化工等行业[3]。大豆磷脂经丙酮脱油后得到大豆粉末磷脂[4]，其主要成分是磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)及少量糖类物质[5]。由于磷脂的来源和生产方式不同，各个组分的含量也不同。通常情况下，磷脂中的糖类物质含量为5%～8%[6]，而经过丙酮脱油后其含量会进一步提高[1]。磷脂中的糖类物质一般分为结构糖和游离糖，其中结构糖主要是一些糖酯类物质，游离糖包括水苏糖、棉子糖、蔗糖等低聚糖[7]。糖类物质的存在会对磷脂品质产生不良影响，如磷脂加工过程中糖类物质会因为加热而发生美拉德反应引起褐变[8]，在很大程度上限制了磷脂在食品工业领域的应用[5]；另外，若静脉输液时有糖存在，很可能会引起输液反应，严重危及病人生命安全[9]。

目前已有关于磷脂脱糖的研究，并且在工业上已经得到了应用。但是脱糖工艺仍存在脱糖率低、操作复杂、成本高、耗时长、试剂残留等问题。因此，本文以大豆粉末磷脂为原料，建立了以乙醇溶液为溶剂对磷脂中的糖类物质进行脱除的单溶剂体系脱糖方法，以脱糖率为指标，通过正交试验优化磷脂脱糖的最佳工艺条件，并采用HPLC对所得糖类物质进行了鉴定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大豆粉末磷脂：江苏曼氏生物科技有限公司；无水乙醇、浓硫酸、苯酚、葡萄糖：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；去离子水；水苏糖、棉子糖、蔗糖标准品：含量均大于99%，美国Sigma公司。

RE-52A型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；TG18G离心机：盐城凯特实验仪器有限公司；ZK-072 型真空干燥箱：上海市实验仪器总厂；UV-2100 型紫外可见分光光度计：尤尼柯(上海)仪器有限公司；Waters 2695高效液相色谱仪、2414示差折光检测器：美国Waters公司。

1.2 试验方法

1.2.1 苯酚-硫酸法测定总糖含量

总糖含量的测定方法参考文献[1，10]。准确称量干燥至恒重的葡萄糖1.0 g于1 000 mL容量瓶中，用去离子水定容，混匀，使其完全溶解，配制成1.0 mg/mL的葡萄糖标准贮备液，备用。分别取标准贮备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL 稀释成10、20、30、40、50、60、70、80、90 μg/mL 标准溶液。分别吸取标准溶液2.0 mL各3份于具塞比色管中，再分别加入1.0 mL、6%的苯酚溶液，迅速摇匀，再分别缓慢加入5.0 mL、95.5%的浓硫酸于各比色管中，混匀。然后于沸水浴中20 min让其充分显色，再于冰浴中冷却20 min，在490 nm处测定其吸光度。以经过相同处理的2.0 mL去离子水为对照组。以葡萄糖溶液质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，见图1。磷脂原料、脱糖磷脂和粗糖中的总糖含量的测定同上(用2.0 mL样品代替2.0 mL葡萄糖标准溶液即可)。

图1 葡萄糖标准曲线

1.2.2 大豆粉末磷脂脱糖试验

取大豆粉末磷脂10 g于250 mL的锥形瓶中，按一定料液比加入不同体积分数的乙醇溶液，在一定温度下搅拌一定时间，静置后以8 000 r/min的速度离心分离15 min，下层磷脂重复脱糖几次，合并上层溶液，将上层溶液和下层磷脂分别减压浓缩得到粗糖和脱糖磷脂产品。考察乙醇体积分数、脱糖温度、料液比、脱糖时间、脱糖次数对脱糖率的影响。采用苯酚-硫酸法测定粗糖和脱糖磷脂中的总糖含量。

脱糖率=所得粗糖中总糖质量/粉末磷脂中总糖质量×100%

粗糖纯度=粗糖中总糖质量/粗糖质量×100%

1.2.3 糖类物质的HPLC鉴定

样品配制：用一定量的去离子水溶解所得纯化糖(粗糖经正己烷纯化)样品，配制质量浓度为10 mg/mL 样品溶液，经0.22 μm膜过滤，采用外标法对糖类物质进行HPLC检测。

HPLC条件：Waters 2695高效液相色谱仪，2414示差折光检测器；安捷伦氨基色谱柱(250 mm×4.6 mm)，柱温35℃；流动相为乙腈-水(体积比为65∶35)；流速1.0 mL/min。

蔗糖、棉子糖、水苏糖标准溶液的配制：分别准确称量一定质量的蔗糖、棉子糖、水苏糖于10 mL容量瓶中，用去离子水定容，混匀，使其完全溶解，配制成20～100 mg/mL标准溶液，对不同糖含量标准溶液进行HPLC分析，重复3次。以糖含量为横坐标，积分面积为纵坐标绘制标准曲线，见图2。以纯化糖中各糖的积分面积计算对应糖的含量。

图2 蔗糖、棉子糖、水苏糖的标准曲线

2 结果与讨论

2.1 原料总糖含量

采用1.2.1中苯酚-硫酸法测总糖含量的方法，对大豆粉末磷脂原料中总糖的含量进行测定，得到大豆粉末磷脂原料中总糖含量为10.2%。

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇体积分数对脱糖率的影响

在料液比1∶10、脱糖温度30℃、脱糖时间60 min 条件下脱糖1次，考察乙醇体积分数45%、50%、55%、60%、65%对脱糖效果的影响，结果如图3所示。

图3 乙醇体积分数对脱糖率的影响

由图3可知，脱糖率随乙醇体积分数的增大先升高后大幅度降低。这可能是因为乙醇体积分数较低时，水的比例相对较大，使得大部分磷脂呈乳化状态，而这既不利于糖的脱除，也不利于之后的分离。当乙醇体积分数升高时，水的比例相应降低，溶液的极性变小，磷脂呈现颗粒状态。乙醇体积分数55%时磷脂呈现非常细小均匀肉眼可见的颗粒，这种状态既有利于糖向溶液中扩散，也有利于之后的分离操作。直到乙醇体积分数增大到60%以上时，磷脂开始结块，阻碍了糖类向溶液中转移，导致脱糖率降低。另外，当含水量过高或过低时，不利于醇溶性或水溶性糖的脱糖。因此，在乙醇体积分数55%时，醇溶性和水溶性糖的脱糖率达到最大值88.75%。综合考虑，选择乙醇体积分数55%。

2.2.2 料液比对脱糖率的影响

在乙醇体积分数55%、脱糖温度30℃、脱糖时间60 min条件下脱糖1次，考察料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14对脱糖效果的影响，结果如图4所示。

由图4可知，脱糖率随着料液比1∶6～1∶10迅速增加，1∶10以后趋于平缓。这是因为当料液比较小时，用到的乙醇溶液占比太小，使磷脂粉末不能充分分散开来，导致脱糖率较小。增大料液比，大豆粉末磷脂和溶液完全接触，糖类物质得以充分转移，脱糖率增大。综合考虑，选择料液比为1∶10。

图4 料液比对脱糖率的影响

2.2.3 脱糖时间对脱糖率的影响

在乙醇体积分数55%、料液比1∶10、脱糖温度30℃条件脱糖1次，考察脱糖时间10、30、50、70、90 min 对脱糖效果的影响，结果如图5所示。

图5 脱糖时间对脱糖率的影响

由图5可知，脱糖率在10～50 min内迅速增加，50 min以后趋于平缓。其原因是液固两相需要时间充分混合，充分混合后磷脂表面的糖会被浸洗到溶液中，而磷脂内部的糖需要先扩散到磷脂表面之后才能转移到溶液中，这也需要一定时间。综合考虑，选择脱糖时间为50 min。

2.2.4 脱糖温度对脱糖率的影响

在乙醇体积分数55%、料液比1∶10、脱糖时间50 min条件脱糖1次，考察脱糖温度25、30、35、40、45℃对脱糖效果的影响，结果如图6所示。

图6 脱糖温度对脱糖率的影响

由图6可知，脱糖率随着脱糖温度的升高呈现出先增加后降低的趋势，并在35℃时达到最大值。原因可能是温度的升高会加快溶液的扩散，有利于糖从固相转移到液相中，而温度过高会降低溶液对糖的选择性，从而导致脱糖率下降。综合考虑，选择脱糖温度为35℃。

2.2.5 脱糖次数对脱糖率的影响

在乙醇体积分数55%、料液比1∶10、脱糖温度35℃、脱糖时间50 min条件下，考察脱糖次数1、2、3、4、5次对脱糖率的影响，结果如图7所示。

图7 脱糖次数对脱糖率的影响

由图7可知，脱糖率随着脱糖次数的增加缓慢升高。可能是因为1次脱糖就将大部分的游离糖脱了出来，只剩余少量的游离糖和结合糖。继续脱糖磷脂中残余的游离糖不断被脱除，而结合糖是不能被脱除的。综合考虑，选择脱糖次数为1次。

2.3 正交试验

2.3.1 正交试验结果与分析

在单因素试验基础上，由于脱糖次数对脱糖率的影响非常小，将脱糖次数定为1次,以脱糖率为指标，选择脱糖温度、乙醇体积分数、脱糖时间、料液比4个因素，每个因素取3个水平，设计L9(34)正交试验。正交试验因素水平见表1，正交试验设计及结果见表2。

表1 正交试验因素水平

由表2可知，各因素对脱糖率影响大小的顺序为：料液比>乙醇体积分数>脱糖时间>脱糖温度。为了进一步确定试验误差和各试验条件是否影响试验结果，将正交试验结果进行方差分析，找出这些因素的主效因子。由于无空白试验做对照，所以按照常规方法将离均差平方和中最小的一项近似作为误差的估计，用来计算各因子列的比值，参考极差分析，决定用脱糖温度作为误差来源项，用SPSS软件进行方差分析，结果见表3。

由表3可知，乙醇体积分数、脱糖时间及料液比对脱糖效果的影响非常显著，脱糖温度对脱糖效果的影响较显著。综合极差分析和方差分析结果，得最佳试验条件为A1B2C2D1，即脱糖温度30℃、乙醇体积分数55%、脱糖时间50 min、料液比1∶8。

表2 正交试验设计及结果

表3 正交试验结果方差分析

2.3.2 最佳条件下的重现性试验

在最佳条件下进行重现性试验，得到粗糖1.36 g，粗糖纯度为66.8%，大豆粉末磷脂的脱糖率为90.64%，脱糖磷脂中总糖含量为1.15%，脱糖磷脂的得率为86.2%，且具有较好的重现性。在最佳条件下大豆粉末磷脂中的总糖含量由10.2%降低到1.15%，脱糖磷脂的得率也较高，说明脱糖效果较好。

2.4 糖类物质的HPLC鉴定

经HPLC检测分析所得纯化糖图谱如图8所示。

图8 纯化糖的HPLC图谱

由图8可知，纯化糖中主要含有蔗糖(tR=5.9 min)、棉子糖(tR=8.0 min)、水苏糖(tR=11.4 min)，且含量分别为11.87%、8.84%、75.16%。

3 结 论

本文建立了单溶液体系的大豆粉末磷脂脱糖方法。通过正交试验得到最佳脱糖条件为：乙醇体积分数55%，脱糖温度30℃，料液比1∶8，脱糖时间50 min，脱糖次数1次。在最佳条件下大豆粉末磷脂脱糖率达90.64%。HPLC鉴定所得纯化糖主要是由蔗糖(11.87%)、棉子糖(8.84%)、水苏糖(75.16%)组成。

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Removal conditions of carbohydrates from soybean powder phospholipid

YIN Ru， PENG Zhen， PAN Lishuang， SONG Yingying， CAO Dong

(School of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， Jiangsu， China)

With soybean powder phospholipid as raw material， a removal method of carbohydrates in single solvent system of ethanol solution was established. The impacts of volume fraction of ethanol， removal temperature， ratio of material to liquid， removal time and removal times on removal rate of carbohydrates were studied， and the removal conditions of carbohydrates were optimized by orthogonal experiment. The results showed that the optimal removal conditions of carbohydrates were obtained as follows：volume fraction of ethanol 55%， removal temperature 30℃， ratio of material to liquid 1∶8， removal time 50 min and removal times once. Under the optimal conditions， the removal rate of carbohydrates from soybean powder phospholipid was 90.64%. The identification result of HPLC turned out that the removed carbohydrates were mainly composed of sucrose， raffinose and stachyose. Their contents were 11.87%， 8.84% and 75.16% respectively. The three main carbohydrates were consistent with soybean oligosaccharides.

soybean powder phospholipid; single solvent system; orthogonal experiment; removal rate of carbohydrates

2016-08-09；

2016-12-16

殷 茹(1991)，女，硕士研究生，研究方向为食品工程(E-mail)1334565974@qq.com。

曹 栋，教授，博士(E-mail)caodong@jiangnan.edu.cn。

TQ645.9；TS202.3

A

1003-7969(2017)03-0113-05