程序进样-柱前衍生-超高效液相色谱法测定鱼露酱油中的牛磺酸含量

孟冰冰，杨桂玲,2，徐惠，于林，马驰骋，陈莎莎，孙娜，杨劭辰

(1.黑龙江省华测检测技术有限公司，哈尔滨 150025；2.哈尔滨市食品工业研究所，哈尔滨 150025；3.SUY有限责任公司，德国 海得堡 69117)

程序进样-柱前衍生-超高效液相色谱法测定鱼露酱油中的牛磺酸含量

孟冰冰1，杨桂玲1,2，徐惠1，于林1，马驰骋1，陈莎莎1，孙娜1，杨劭辰3

(1.黑龙江省华测检测技术有限公司，哈尔滨 150025；2.哈尔滨市食品工业研究所，哈尔滨 150025；3.SUY有限责任公司，德国 海得堡 69117)

采用程序进样-柱前衍生-超高效液相色谱法，在波长为330 nm下测定鱼露酱油中的牛磺酸含量，得到结果：最小检出限为5 mg/kg，定量限为15 mg/kg，线性方程为Y=6.28X-1.01，相关系数R2=0.9998，回收率在95%～105%，相对标准偏差低于10%。该方法准确，有很好的灵敏度和回收率，可以用于鱼露酱油中牛磺酸的测定。

程序进样；柱前衍生；超高效液相色谱法；牛磺酸

1 概述

牛磺酸(taurine)又称β-氨基乙磺酸，为白色的、无臭的斜状晶体。牛磺酸的化学性质稳定，不溶于乙醚等有机溶剂，是一种含硫的非蛋白的氨基酸[1,2]。牛磺酸分布于动物组织细胞内，主要功能为促进婴幼儿脑组织和智力发育，提高神经传导和视觉机能，防止心血管疾病的产生以及影响糖的代谢和改善记忆。因此，牛磺酸为人体不可缺少的营养元素之一，并且作为营养强化剂被广泛地添加到各类食品和婴幼儿奶粉中[3-5]。

目前牛磺酸的测定方法主要有中和滴定法、液相色谱仪-柱前衍生法和柱后衍生法、气相色谱法等[6-13]。本研究采用程序进样、柱前衍生的方式对牛磺酸进行测定，使用较小的衍生化试剂，在进样器内完成整个衍生实验，操作简单，降低了实验过程中产生的操作误差，为牛磺酸的测定提供了可靠的依据。

2 实验方法

2.1 仪器与试剂

2.1.1 仪器和试剂

Agilent 1290超高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，同时配有DAD检测器；LC OpenLab CDS Chem Station，版本为C.01.07；KQ-300GVDV超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；MS3 漩涡混匀仪(IKA公司)；乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)，德国默克公司；超纯水(屈臣氏)；针式滤器(0.22 μm×25 mm)PTFE(上海安谱)；牛磺酸标准品纯度99%(阿拉丁)；硼酸(科密欧)、氢氧化钾(科密欧)、邻苯二甲醛(英国ALFA)、乙硫醇(上海安谱)、Brij-35(上海安谱)。

2.1.2 衍生化试剂的配制

硼酸钾溶液：30.9 g硼酸+26.3 g氢氧化钾用水定容至1000 mL；0.6 g邻苯二甲醛(OPA)+10 mL甲醇+0.5 mL乙硫醇+0.35 g Brij-35 用硼酸钾水溶液定容至1000 mL。

2.2 样品前处理

取1 mL的鱼露酱油，加水稀释至10 mL，通过针式滤器将已净化的样品装入样品瓶中。将已配制好的衍生化试剂通过针式滤器装入样品瓶中。

2.3 仪器条件

2.3.1 色谱条件

色谱柱为:Agilent ZORBAX EXTEND-C18(2.1 mm×50 mm×1.8 μm，美国Agilent公司)；柱温为30 ℃； 检测波长为330 nm；流动相为甲醇和水；流速为0.3 mL/min。

2.3.2 进样器条件

抽取(在默认位置P1-D5上抽取5 μL)；洗针(P1-D6)；抽取(在默认位置P1-D5上抽取5 μL)；洗针(P1-D8)；混合(在针座中，共3次)；等待(0.1 min)；排出(排出5 μL至 P1-D1上)；进样；洗针(在P1-D8上共洗2次)。

3 结果与分析

3.1 衍生化条件的选择

柱后衍生法：主要使用OPA为衍生化试剂，使用荧光检测器来测定牛磺酸。该方法简单、快捷，但是使用较大量的衍生化试剂，有一定的毒性，防护不好易对实验人员及环境产生危害；柱前衍生法：主要使用氮磺酰氯为衍生化试剂，使用二极管阵列检测器来测定牛磺酸。该方法使用衍生化试剂的剂量较小，但是稳定性较差，样品在冷藏条件下仅能保存2天，对实验人员的实验技能要求较高。而使用程序进样-柱前衍生法解决了衍生物不稳定的难题，衍生后无需人员操作即可自动进入色谱柱内进行分析，提高了工作效率，减少了人员操作而产生的误差。使用Agilent ZORBAX EXTEND-C18色谱柱对牛磺酸进行分离，得到的色谱图见图1～图4。

图1 牛磺酸标准品的色谱图(浓度为5 mg/L)

图2 空白试剂的色谱图

图3 样品中牛磺酸的色谱图

图4 样品中添加牛磺酸的色谱图(添加牛磺酸含量为5 mg/L)

在实验过程中，需要做试剂空白(试剂空白：使用水直接进行衍生)。在实际计算样品含量时，样品中的牛磺酸含量应当扣除试剂空白值。试剂空白值理论上不应高于预测值的10%，如超过10%则应考虑更换试剂品牌和器皿。

3.2 衍生化试剂的选择

分别使用邻苯二甲醛衍生化试剂和丹磺酰氯衍生化试剂对牛磺酸进行柱前衍生，结果为使用丹磺酰氯衍生化试剂进行柱前衍生灵敏度没有使用邻苯二甲醛衍生化试剂低，色谱峰有较明显的拖尾现象，稳定性要低于使用邻苯二甲醛衍生化试剂对牛磺酸进行柱前衍生，综合考虑，使用邻苯二甲醛衍生化试剂为本研究最终使用的衍生化试剂。

3.3 回收率、精密度、线性范围和检出限

使用水对牛磺酸标准品进行稀释，使其浓度为0，10，20，30，40，100 mg/L。将此6点6个浓度的水平进行添加回收试验, 每个水平做6个平行，计算平均值。使用外标法进行定量，得到结果为在0～100 mg/L线性范围内回收率良好，且最小检出限为5 mg/kg，定量限为15 mg/kg，线性方程为Y=6.28X-1.01，相关系数R2=0.9998，回收率在95%～105%，相对标准偏差低于10%。

表1 牛磺酸的回收率及RSDs(n=6)

4 结论

使用程序进样-柱前衍生-超高效液相色谱法测定鱼露酱油中的牛磺酸含量，方法简单快速，准确度和灵敏度高， 实验成本低、毒性小，适合饮料中牛磺酸含量的测定。

[1]张彤,山广志,余立.柱后衍生HPLC法测定牛磺酸颗粒的含量[J].中国新药杂志，2010(4):83-85.

[2]刘辉,徐应军,周瑞华,等.荧光法测定啤酒中牛磺酸含量[J].酿酒科技，2005(5):87-88,91.

[3]张燕婉.氨基酸分析仪法测定肉食品中牛磺酸含量[J].肉类研究，1996(1):37-39,47.

[4]李秀花,邱服斌,肖荣,等.紫外分光光度法测定动物脑组织中牛磺酸含量[J].山西医药杂志，2001(3):25-26.

[5]叶思平,陈悦娇,陈海光,等.高效液相色谱测定益智仁中的牛磺酸含量[J].食品科学，2013(10):212-214.

[6]高加龙,章超桦,刘书成,等.邻苯二甲醛柱前衍生高效液相色谱法测定马氏珠母贝中牛磺酸含量[J].广东海洋大学学报，2007(1):59-62.

[7]李咏梅,李人宇.高灵敏分光光度法测定贝类中牛磺酸含量[J].现代化工，2013(10):140-143.

[8]徐凤云,杨玉霞.HPLC法柱后衍生测定乳粉中牛磺酸含量不确定度评定[J].生命科学仪器，2009(6):48-50.

[9]A M Petrosian,J E Haroutounian. Taurine as a universal carrier of lipid soluble vitamins: a hypothesis[J].Amino Acids,2000(2):409-421.

[10]孙变娜,沈和定,吴洪喜,等.高效液相色谱法测定4种石磺中牛磺酸的含量[J].海洋渔业，2015(1):95-100.

[11]刘亚风,祝伟霞,袁萍,等.超高效亲水作用色谱-蒸发光散射检测牛磺酸颗粒和牛磺酸滴眼液中牛磺酸的含量[J].分析试验室，2011(3):107-109.

[12]方灿.柱前衍生-高效液相色谱法测定七维牛磺酸口服溶液中牛磺酸的含量[J].药物分析杂志，2007(7):172-174.

[13]Angelo Zinellu,Salvatore Sotgia,Scanu Bastianina,et al. Taurine determination by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection: from clinical field to quality food applications[J].Amino Acids，2009(1):155-159.

Determination of Taurine in Fish Sauce by Program Sampling-Precolumn Derivatization-Ultra Performance Liquid Chromatography

MENG Bing-bing1, YANG Gui-ling1, XU Hui1,YU Lin1, MA Chi-cheng1,CHEN Sha-sha1, SUN Na1, YANG Shao-chen3

(1.Centre Testing International Corporation,Harbin 150025,China; 2.Harbin Food Industry Institute,Harbin 150025,China; 3.SUY GmbH,Heidelberg 69117,Germany)

The taurine in fish sauce is detected by program sampling-precolumn derivatization-ultra performance liquid chromatography at a wavelength of 330 nm, the results are as follows: the minimum detection limit is 5 mg/kg, and the quantitation limit is 15 mg/kg, the linear equation is Y=6.28X-1.01, the correlation coefficient is 0.9998. The recovery rate is in the range of 95%～105%, and the relative standard deviation is less than 10%. The method is accurate, with good sensitivity and recovery, and it can be used for the determination of taurine in fish sauce.

program sampling；precolumn derivatization；ultra performance liquid chromatography；taurine

2016-12-09

孟冰冰(1981-)，女，黑龙江哈尔滨人，硕士，研究方向：植物保护。

TS264.21

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.05.032

1000-9973(2017)05-0138-03