有氧运动与膳食干预对IR大鼠胰岛β细胞LKB1／AMPK信号的影响

王孝强，李 荀，曾凡星

（1.北京体育大学运动人体科学学院，北京100084；2.山东体育学院体育科学研究院，山东济南250102）

有氧运动与膳食干预对IR大鼠胰岛β细胞LKB1／AMPK信号的影响

王孝强1，李 荀2，曾凡星1

（1.北京体育大学运动人体科学学院，北京100084；2.山东体育学院体育科学研究院，山东济南250102）

目的：探讨有氧运动与膳食干预对胰岛素抵抗（IR）大鼠胰岛β细胞LKB1／AMPK信号的影响，进一步阐明有氧运动与膳食干预改善IR的中心机制。方法：采用10w高脂膳食喂养的方法建立IR大鼠模型，建模成功后随机分为高脂膳食组（IRHC）、高脂膳食运动组（IRHE）、普通膳食组（IRNC）、普通膳食运动组（IRNE）；正常大鼠随机分为安静对照组（NC）和单纯运动组（NE）。运动组大鼠进行中等强度有氧运动，跑台速度为20 m／min，坡度0%，60 min／d，5 d／w，共计8 w。末次运动后24 h，禁食12 h后麻醉处死并取材。测定空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）、C肽、肿瘤抑制因子（LKB1）、腺苷蛋白激酶（AMPKα）蛋白和磷酸化表达。结果：1）10 w高脂膳食喂养后大鼠与普通膳食组相比体重、FBG、FINS、Homa-IR均显著升高（均P＜0.01），Homa-ISI显著下降（P＜0.01）。2）有氧运动与膳食干预8 w后对IR大鼠的影响：与NC组相比，NE组大鼠体重、FBG、C肽显著降低（P＜0.05－0.01），胰岛β细胞p-AMPKαThr172表达显著升高（P＜0.05）。与IRHC组相比，IRHE组和IRNE组大鼠体重、FBG、FINS、C肽、Homa-IR均显著降低（P＜0.05－0.01）、Homa-ISI均显著升高（P＜0.05－0.01），IRNC组大鼠体重、C肽均显著降低（P＜0.01）。与IRHC组相比，IRNC组和IRNE组大鼠胰岛β细胞LKB1、AMPKα、p-AMPKαThr172蛋白表达均显著升高（P＜0.05－0.01）。结论：长期高脂膳食可降低胰岛β细胞LKB1／AMPK信号蛋白表达，促进胰岛素分泌；8 w膳食干预可增加IR大鼠胰岛β细胞LKB1／AMPK信号蛋白表达，减少胰岛素分泌。

有氧运动；膳食干预；胰岛素抵抗；胰岛β细胞；LKB1／AMPK

研究表明，有氧运动可有效预防和改善胰岛素抵抗（Insulin Resistance，IR）的发生和发展，相关研究多集中于骨骼肌、肝脏，对胰岛研究较少。近期有研究表明［1］，长期有氧运动也可改善胰岛β细胞功能，表现为在正常及肥胖胰岛素抵抗人群，运动可减少胰岛素分泌；在糖尿病人群，运动可增强胰岛素分泌。AMPK可能是参与这一过程的重要途径之一，已有研究证实［2］。长期激活胰岛β细胞腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）可负向调节胰岛素分泌。LKB1是调控AMPK的上游激酶，可通过磷酸化激活AMPKα来调控胰岛素合成与分泌。有氧运动和膳食干预是否通过调控LKB1／AMPK信号，改善胰岛β细胞功能进而改善IR，尚需实验进一步探讨。因此本研究采用高脂饲料喂养诱导IR大鼠模型，探讨有氧运动和膳食干预对IR大鼠胰岛β细胞AMPK的影响，为有氧运动改善IR提供新的理论依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

7 w龄SPF级SD雄性大鼠100只，体重（228.7 ±8.9）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012－0001。大鼠的饲养、训练均于北京体育大学实验动物中心内进行，分笼饲养，每笼4只，自由饮水、进食。环境温度20℃～24℃，相对湿度45%～55%，昼夜12～12 h循环照明。

1.2 研究方法

1.2.1 实验分组及干预方案

大鼠适应性喂养1 w后，随机挑选20只为普通膳食组，采用标准饲料喂养；其余80只大鼠以高脂饲料（D12492：脂肪59.9%kcal、碳水化合物20.1% kcal、蛋白质20.0%kcal）喂养10 w，以建立IR模型。每周固定时间监测大鼠体重，于第10 w，剪尾取血测定空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS），用稳态模型评估法［3］计算胰岛素抵抗指数（Homa-IR）和胰岛素敏感指数（Homa-ISI），以确定IR模型建立成功。

造模成功后，选取IR大鼠40只和20只普通大鼠进行为期5 d的跑台适应性训练，休息2 d后，IR大鼠随机分为4组，每组10只：高脂膳食安静组（IRHC）、高脂膳食运动组（IRHE）、普通膳食安静组（IRNC）、普通膳食运动组（IRNE）。普通大鼠随机分为2组，每组10只：安静对照组（NC）和单纯运动组（NE），均以普通饲料喂养。

运动方案：运动组大鼠进行中等强度有氧运动，跑台速度为20 m／min，坡度0%，60 min／d，5 d／w，共计8 w。负荷设定参照国际通用的Bedford运动负荷标准［4］。见表1。

表1 大鼠适应性训练方案

1.2.2 组织取样及处理

运动组大鼠于末次运动后24 h取材，取材前禁食12 h，以3 ml／kg体重腹腔注射10%水合氯醛麻醉，行腹主动脉取血，测定FBG、FINS、空腹C肽。取胰尾［5－6］分成两部分，分别置于－80℃保存和4%多聚甲醛固定，用于Western blot和免疫组化测定。

1.2.3 测试指标及方法

1.2.3.1 空腹血糖测定 采用葡萄糖氧化酶法进行血糖测定，分别在10 w造模后以及运动第8 w末次运动后24 h时测定。大鼠禁食12 h后（早8：00），进行剪尾取血，使用强生稳豪倍易型（OneTouch UltraEasy）血糖仪及配套试纸测定FBG。

1.2.3.2 空腹胰岛素、C肽测定 FINS、空腹C肽水平分别采用Rat insulin ELISA试剂盒（瑞士Mercodia）、Rat C-Peptide ELISA试剂盒（瑞士Mercodia）进行测定。测定步骤严格根据试剂盒说明书进行。

1.2.3.3 LKB1、AMPKα及p-AMPKαThr172蛋白表达进行测定 采用Western Blot方法对LKB1、AMPKα及p-AMPKαThr172蛋白表达进行测定。1）总蛋白提取：取100 mg胰尾，于研钵内液氮环境下研磨成粉，置于EP管中，加入1 mL含有蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂及PMSF的RIPA裂解液，冰上静置20 min后，于4℃，12 000 g，离心10 min，取上清液。采用BCA法进行蛋白浓度测定，按试剂盒（碧云天生物技术有限公司）说明书进行。2）Western Blot：取20μg总蛋白配制成上样体系，100℃煮沸5 min。将样品加入到SDS-PAGE胶中，浓缩胶90 V，分离胶120 V，恒压电泳。采用湿式转膜法将蛋白转移至PVDF膜，250 mA恒流转膜2 h。用5%BSA室温封闭2 h后，加入浓度1：500的一抗LKB1、AMPKα、p-AMPKαThr172、β-actin（Santa curz）4℃孵育过夜。TBST清洗后，加入适当浓度的二抗，室温孵育1 h。清洗后，将ECL发光液A、B等量混合后滴加到膜上，使用Bio-Rad凝胶成像系统的Image Lab 5.1进行成像。采用目的蛋白条带与相应β-actin的光密度值的比值作为其蛋白的表达量；以各组的蛋白表达量与安静对照组的比值作为其蛋白的相对表达量。

1.2.3.4 免疫组化的测定 胰尾经4%多聚甲醛固定后，经梯度乙醇进行脱水、透明后制作石蜡切片，经EDTA抗原修复缓冲液进行抗原修复，3%过氧化氢溶液进行内源性过氧化物酶阻断，BSA封闭，加一抗4℃过夜后加相应二抗，DAB显色，苏木素复染细胞核，脱水封片。拍照后使用Image-pro plus 6.0软件进行图像分析，计算平均光密度值（IOD）。

1.2.4 统计学分析

采用SPSS 16.0软件进行统计分析。实验数据用平均数±标准差（¯X±S）表示。属正态分布者，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行组间比较，采用LSD方法进行组间多重比较。采用双因素单变量方差分析进行有氧运动和膳食的主效应及两者的交互作用分析。P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示有非常显著性差异。

2 结果

2.1 胰岛素抵抗模型的建立

2.1.1 体重的变化

实验前HFD组和N组大鼠体重无显著性差异。10 w的造模过程中两组大鼠体重持续增长，HFD组大鼠每周均有显著增长（1 w～9 w，P＜0.01；10 w，P＜0.05），N组大鼠体重前6 w显著增长（1 w～5 w，P＜0.01；6 w，P＜0.05），第7 w起，增长趋势缓慢（7 w，P＝0.06；9 w，P＝0.06；10 w，P＝0.14）。从造模第2 w起，HFD组体重与N组相比增长了3.4%，具有显著性差异（P＜0.05），随着实验进行，两组之间体重差异继续增大，均呈显著性差异（P＜0.01）。胰岛素抵抗模型的建立期间各组大鼠体重变化如图1所示。

2.1.2 血液指标的变化

造模结束时，两组大鼠血液指标的变化如表2所示。与N组相比，HFD组大鼠FBG、FINS、Homa-IR显著升高，分别升高了18.3%（P＜0.01）、31.9%（P＜0.01）、78.7%（P＜0.01）；Homa-ISI显著，下降了14.6%（P＜0.01）。

图1 造模期间大鼠体重的变化

表2 造模结束时大鼠空腹血糖、胰岛素的变化

2.2 运动与膳食干预对IR大鼠体重、血液指标及蛋白表达的影响

2.2.1 运动与膳食干预对IR大鼠体重、血液指标的影响

经过8 w运动与膳食干预后，各组大鼠体重、血液指标的变化如表3所示。经过8 w有氧运动干预后，与NC组相比，NE组大鼠体重、FBG、FINS、空腹C肽、Homa-IR分别下降了17.88%（P＜0.01）、11.65%（P＜0.05）、6.95%、26.69%（P＜0.05）、26.83%，Homa-ISI升高了8.43%；与IRHC组相比，IRHE组大鼠体重、FBG、FINS、空腹C肽、Homa-IR分别下降了20.02%（P＜0.01）、14.94%（P＜0.01）、43.29%（P＜0.05）、42.55%（P＜0.01）、54.40%（P＜0.01），Homa-ISI升高了15.49%（P＜0.01）。

经过8 w膳食干预后，与IRHC组相比，IRNC组大鼠体重、FBG、FINS、空腹C肽、Homa-IR分别下降了9.50%（P＜0.01）、14.73%（P＜0.01）、5.37%、42.55%（P＜0.01）、20.60%，Homa-ISI升高了7.75%。

经过8 w有氧运动联合膳食干预后，与IRHC组相比，IRNE组大鼠体重、FBG、FINS、空腹C肽、Homa-IR分别下降了23.79%（P＜0.01）、14.73%（P＜0.01）、42.60%（P＜0.05）、55.05%（P＜0.01）、64.84%（P＜0.01），Homa-ISI升高了21.36%（P＜0.01）。

通过对运动与膳食进行双因素方差分析，统计分析结果表明，运动因素对IR大鼠体重、FBG、FINS、空腹C肽、Homa-IR、Homa-ISI有显著性影响（P＜0.05－0.01）；膳食因素对IR大鼠体重、空腹C肽有显著性影响（P＜0.01）；运动和膳食因素对IR大鼠体重、FBG、FINS、空腹C肽、Homa-IR、Homa-ISI未呈现出显著性交互作用，见表3。

表3 运动与膳食干预后各组大鼠体重、血液指标的变化

2.2.2 运动与膳食干预对IR大鼠胰岛β细胞LKB1蛋白表达的影响

干预结束后，LKB1蛋白水平NE组较NC组大鼠升高了24.4%（P＝0.086）；IRHC组与NC组相比显著降低（P＜0.01），下降了53.3%；IRHE组与IRHC组大鼠升高了8.51%，但无显著性；IRNC组、IRNE组与IRHC组大鼠相比显著升高（P＜0.05），分别升高了72.34%、61.70%。

双因素方差分析显示，运动因素未对LKB1蛋白水平呈现出显著性影响，膳食因素对LKB1蛋白水平具有显著影响（P＜0.05）；对两者交互作用进行检验，结果显示两者不具有交互作用。8w干预后各组大鼠胰岛β细胞LKB1蛋白表变化见图2。

图2 胰岛β细胞LKB1蛋白表达水平的变化

2.2.3 运动与膳食干预对IR大鼠胰岛β细胞AMPKα及其磷酸化蛋白表达的影响

Western Blot结果显示经过8w有氧运动与膳食干预后，与NC组大鼠相比，NE组AMPKα蛋白相对表达量升高了19.3%，但无显著性差异；IRHC组显著降低，下降了44.9%（P＜0.01）。与IRHC组大鼠相比，IRNC组显著，升高了72.2%（P＜0.01）；IRHE组、IRNE组分别升高了8.7%、50.5%（P＝0.053），但无显著性差异。

与NC组大鼠相比，NE组p-AMPKαThr172蛋白相对表达量显著升高，升高了32.2%（P＜0.01）；IRHC组显著降低，下降了42.8%（P＜0.01）。与IRHC组大鼠相比，IRNC组、IRNE组均显著升高，分别升高了100.0%、63.3%（P＜0.01；P＜0.01）；IRHE组升高了48.8%，但无显著性差异。

通过对运动与膳食进行双因素方差分析，统计结果表明，运动因素对AMPKα、p-AMPKαThr172蛋白相对表达量未呈现出显著性影响，膳食因素对AMPKα、p-AMPKαThr172蛋白相对表达量具有显著性影响（P＜0.05），运动和膳食对p-AMPKαThr172蛋白相对表达量具有显著性交互作用，而对AMPKα蛋白相对表达量未呈现出显著性交互作用。8w干预后各组大鼠胰岛β细胞AMPKα、p-AMPKαThr172蛋白表变化见图3。

免疫组化结果显示干预结束后AMPKα平均光密度，与NC组大鼠相比，NE组无显著变化，IRHC显著下降（P＜0.01）；与IRHC组大鼠相比，IRHE组、IRNC组、IRNE组无显著性升高。

干预结束后p-AMPKαThr172平均光密度，与NC组大鼠相比，NE组无显著变化，IRHC显著下降（P＜0.05）；与IRHC组大鼠相比，IRHE组升高25.6%、IRNC组升高66.7%、IRNE组升高48.1%，但均无显著性。8w干预后各组大鼠胰岛β细胞AMPKα蛋白及磷酸化免疫组化结果见表4、图4和图5。

图3 胰岛β细胞AMPK蛋白及磷酸化表达水平的变化

表4 运动与膳食干预后各组大鼠AMPKα、p-AMPKαThr172蛋白平均光密度

图4 运动与膳食干预后各组大鼠AMPKα免疫组化结果（200倍）

3 分析与讨论

3.1 胰岛素抵抗模型的建立

IR是指各种原因使胰岛素摄取和利用葡萄糖的效率下降，胰岛β细胞代偿性地增加胰岛素分泌，以维持血糖的稳定，出现高胰岛素血症［7］。当前研究使用的IR动物模型主要有遗传性肥胖模型、特殊药物型和膳食喂养模型三大类。高脂膳食喂养IR动物模型具有造模时间短、模型稳定及性价比较高优势，而且在病因学上与人类肥胖诱导IR极为相似。本研究采用国际通用的脂肪供能比例占59.9%的高脂饲料D12492，高脂喂养10 w后，HFD组大鼠体重、FBG、FINS、Homa-IR显著高于普通膳食组，而Homa-ISI显著降低，出现了典型的IR症状，提示IR大鼠模型建立成功。

3.2 有氧运动与膳食干预对IR大鼠胰岛素抵抗的影响

运动干预改善慢性代谢性疾病的作用日益引起关注，已有研究发现有规律的身体运动可有效预防和延缓2型糖尿病的发病，提高胰岛素敏感性和改善糖代谢［8］。适宜的运动能够引起机体产生良好的适应，其中安静时的空腹血糖和胰岛素水平低、胰岛素敏感性高的现象早已被人们发现。本实验发现正常大鼠通过8 w有氧运动干预后胰岛素敏感性得到改善、空腹C肽水平显著下降，出现胰岛素节省化现象。周晓勐等研究报道8 w有氧强度跑台运动可使高脂喂养诱导IR小鼠体重、FINS显著降低，OGTT增高，改善IR［9］。本研究也发现单纯8w有氧运动可降低IR大鼠体重、空腹C肽、Homa-IR，增加Homa-ISI，改善IR。

图5 运动与膳食干预后各组大鼠p-AMPKαThr172免疫组化结果（200倍）

研究表明限制能量摄入［10］和低脂膳食［11］均能改善IR状况。本研究发现恢复普通膳食8 w后IR大鼠空腹C肽显著水平显著下降，IR状况得到改善，但没有显著性差异，恢复普通膳食可去除高脂膳食对机体的脂毒性作用，改善胰岛细胞胰岛素的分泌。8 w有氧运动联合膳食干预后IR大鼠IR症状得到显著改善，且效果要优于单纯干预，其原因是联合干预可从增加外周组织胰岛素敏感性和减轻胰岛细胞脂毒性两方面共同作用来改善IR的叠加效应。

3.3 有氧运动与膳食干预对IR大鼠胰岛β细胞LKB1／AMPK信号的影响

AMPK是由催化亚基α、β和调节亚基γ组成的三聚体蛋白激酶复合物，AMPK广泛参与调节细胞代谢的激酶，被称为“能量感受器”。AMPK的激活主要受以下两种方式调节：1）由AMP直接变构激活。2）激活的上游激酶可逆的磷酸化AMPKα亚基的Thr172位点。长期激活胰岛β细胞AMPK可负向调节胰岛素分泌，葡萄糖刺激胰岛β细胞时，首先经细胞膜上GLUT2转运至β细胞内，在葡萄糖激酶（GCK）作用下代谢生成ATP，ATP／ADP比值增加，使细胞膜上ATP敏感的K＋／ATP通道关闭，膜去极化，从而诱发动作电位，Ca2＋通道开放，使胞外Ca2＋内流，胞浆内Ca2＋浓度升高，最终启动胰岛素的胞外分泌。LKB1／STK11是调控AMPK的上游激酶，可通过磷酸化激活AMPKα来调控胰岛素合成与分泌。Granot等［12］在胰腺LKB1基因敲除小鼠模型中发现，胰岛AMPK磷酸化及活性显著下降，葡萄糖刺激胰岛素分泌及胰岛素含量显著增加；并通过MIN6细胞培养证实，LKB1通过激活AMPK进而抑制胰岛素含量，见图6。

图6 AMPK在胰岛素分泌过程中的作用［2］

Peyot等［13］研究发现高脂喂养后大鼠胰岛内AMPK活性显著降低，同时出现胰岛β细胞量增加。本研究发现，高脂喂养大鼠后胰岛β细胞LKB1、p-AMPKαThr172、AMPKα的蛋白表达显著性下降，并且出现FINS、空腹C肽水平显著升高，提示高脂喂养诱导胰岛β细胞内LKB1／AMPK信号蛋白表达减少，可进一步代偿性地增加胰岛素分泌，以抵消外周组织IR。运动或机械刺激可激活骨骼肌AMPK，增强骨骼肌内葡萄糖的摄取和利用，增强骨骼肌对胰岛素的敏感性［14］。体力活动可改善脂代谢，降低体重和体脂百分比，也可影响肌肉、脂肪组织和肝脏的胰岛素敏感性，从而改善肥胖和T2DM人群的血糖水平［15］。但本研究表明，经过8w有氧运动干预后，正常大鼠大鼠胰岛β细胞p-AMPKαThr172的蛋白表达显著性升高，而LKB1和AMPKα的蛋白表达有升高趋势，但无显著性；IR大鼠胰岛β细胞LKB1、p-AMPKαThr172、AMPKα的蛋白表达均有升高趋势，但无显著性。有氧运动干预并未引起胰岛β细胞内LKB1／AMPK信号出现显著改变，但大鼠的ISI或IR仍得到改善，可能原因是有氧运动主要是通过改善外周组织的IR，进而间接的减少了胰岛β细胞胰岛素的分泌。

膳食干预是另一类改善IR的方法，限制热量饮食可能通过降体重和脂肪量来改善胰岛素敏感性［10］。Weiss［16］发现膳食干预可通过增强β细胞内的自噬改善糖耐量受损，主要通过维持β细胞的数量、结构和功能来实现。本研究发现单纯膳食或联合干预时IR大鼠胰岛β细胞LKB1、p-AMPKαThr172、AMPKα的蛋白表达出现显著升高，这可能与恢复普通膳食后可直接去除高脂喂养对胰岛β细胞的脂毒性作用有关，减少胰岛β细胞胰岛素的分泌，保护胰岛细胞功能。本研究表明，膳食干预可显著增加IR大鼠胰岛细胞LKB1／AMPK信号，提示膳食干预可能通过激活胰岛细胞LKB1／AMPK信号来改善胰岛细胞功能。

4 结论

长期高脂膳食可降低胰岛β细胞LKB1／AMPK信号蛋白表达，促进胰岛素分泌；8 w膳食干预可增加IR大鼠胰岛β细胞LKB1／AMPK信号蛋白表达，减少胰岛素分泌。

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责任编辑：郭长寿

Effects of Aerobic Exercise and Diet Intervention on LKB1／AMPK Signal in IsletβCell in IR Rats

WANG Xiaoqiang1，LIXun2，ZENG Fanxing1
（1.Sport Science College，Beijing Sport University，Beijing 100084，China；2.Sport Science Research Center，Shandong Sport University，Jinan 250102，Shandong，China）

Objective：To investigate the impactof aerobic exercise and diet intervention on LKB1／AMPK Signal in the islet βcell of insulin resistance rats.Methods：High-fat diet-induced insulin resistance rats were random ly divided into high-fat diet sedentary control group（IRHC），high-fat diet exercise group（IRHE）and normal diet sedentary group（IRNC），normal diet exercise group（IRNE）.The normal rats were random ly divided into sedentary control group（NC）and exercise group（NE）.Rats in all exercise groups underwent amoderate intensity treadm ill（20m／m in，0%，60 m in／d，5d／w）for 8 weeks. The blood in abdom inal aorta and islet were collected after 12h fasting，FBG，FINS，C-peptide，LKB1，AMPKαand p-AMPKαThr172 weremeasured.Results：1.Compared w ith the control group，the body weight，FPG level，FINS and HOMA-IR of IRHE significantly increased after10 weeks（all P＜0.01），Homa-ISIsignificantly decreased（P＜0.01）.2.The effect of aerobic exercise and diet changed.Compared w ith NC，the body weight，FBG and C-peptide of rats in NE significantly decreased（P＜0.05－0.01）and the protein expression of p-AMPKαThr172 in isletβcell significantly increased（P＜0.05）.Compared w ith IRHC，the body weight，FBG，FINS，C-peptide and Homa-IR（P＜0.05－0.01）of rats in IRHE and IRNE significantly decreased and Homa-ISIsignificantly increased（P＜0.05－0.01）；The body weight and C-peptide significantly decreased（P＜0.01）.The protein expression of LKB1，AMPKαand p-AMPKαThr172（P＜0.05－0.01）in isletβcell of rats in IRNC and IRNE significantly increased.Conclusions：Long-term high-fat diet can reduce the expression of LKB1／AMPK in pancreaticβ-cell，leading to promote insulin secretion.The restoration of normal diet can increase the expression of LKB1／AMPK in pancreaticβ-cell，decrease insulin secretion.

aerobic exercise；dietary intervention；insulin resistance；isletβcell；LKB1／AMPK

G804.7

A

1004－0560（2017）02－0072－07

2017-02-23；

2017-03-25

中央高校基本科研业务费专项资金资助课题（2015SYS013、2016BS024）。

王孝强（1987—），男，博士研究生，主要研究方向为运动生理学。

曾凡星（1956—），男，教授，博士生导师，主要研究方向为体育运动中内分泌变化及适应机制。