酶消化联合强酸消化法的硅藻检验

姚建，阚卫军

（南通市公安局物证鉴定所，江苏南通 226007）

·技术与应用·

酶消化联合强酸消化法的硅藻检验

姚建，阚卫军

（南通市公安局物证鉴定所，江苏南通 226007）

目的采用酶消化联合强酸消化法对溺死尸体的器官进行硅藻检验，并评价其应用价值。方法收集40例本地区确证为溺死的尸体，每例提取肺、肝、肾组织及现场水样，分别采用强酸消化法、酶消化联合强酸消化法、酶消化法对组织样本进行硅藻检验，从消化时间、消化能力、硅藻检出率等方面进行比较分析。结果在消化时间、消化能力方面，酶消化联合强酸消化法明显优于酶消化法；在硅藻检出率方面，酶消化联合强酸消化法明显优于强酸消化法。结论酶消化联合强酸消化法结合了强酸消化法和酶消化法的优点，并且操作安全，环境污染小，具有一定的推广和实践价值。

法医病理学；溺死；硅藻；强酸消化法；酶消化法

在法医检案实践中，时常会遇到溺死尸体器官的硅藻检验。硅藻检验的方法很多，传统方法有强酸消化法、酶消化法、浸渍法、硅胶梯度离心法、焚灼法等[1，2]，近年来又相继研发出多种新方法，如DNA检测法[3]、微波消解-扫描电镜法[4]、微束X射线荧光光谱技术[5，6]。其中强酸消化法、酶消化法较具代表性，是目前国内实际检案中的标准方法和常用方法，适合基层实际办案需要。梁新华等[7]曾对强酸消化法和胰蛋白酶消化法检验腐败器官硅藻进行了比较研究，结果显示强酸消化法的消化时间、消化能力明显优于胰蛋白酶消化法，而强酸消化法的硅藻检出率低于胰蛋白酶消化法。本研究在梁新华等研究的基础上，采用酶消化联合强酸消化法检验器官硅藻，同时与强酸消化法、酶消化法在消化时间、消化能力和硅藻检出率等方面进行比较，旨在能找到一种简单、科学、安全并且适合基层应用的硅藻检验新方法。

1 材料与方法

1.1 样本

收集本地区确证为溺死的尸体40例，尸体解剖时分别提取肺、肝、肾组织，并提取每例案件的现场水样。

1.2 试剂和仪器

蛋白酶K（德国Merck公司），发烟硝酸（上海化学试剂研究所有限公司），0.01mol/L Tris-HCl缓冲液，蒸馏水。

YCX-1型水浴锅（上海亮研智能科技有限公司），DHG-9070型恒温箱（上海精宏实验设备有限公司），2-16P型离心机（德国SIGMA公司），HAKD-H型烘片机（北京恒奥德仪器仪表有限公司），20510型天平（宁波百诺科教设备有限公司），Axioskop 2plus型显微镜（德国蔡司公司）。

1.3 方法

1.3.1 取材

用蒸馏水充分清洗器官表面，提取被膜下的肺、肝、肾组织各3份，每份5 g，分别用于酶消化联合强酸消化法、强酸消化法[8]、酶消化法[9]实验。

1.3.2 酶消化联合强酸消化法操作步骤

（1）将所取组织用干净剪刀充分剪碎后移入玻璃试管中；（2）向玻璃试管中加入0.01mol/L Tris-HCl缓冲液10m L，并加入蛋白酶K 0.2 g，置于56℃水浴锅内1h；（3）以离心半径6cm，2500 r/min，离心10min，弃去上清液，加入发烟硝酸1m L，置于酒精灯上加热，至溶液澄清透明；（4）以离心半径6 cm，2 500 r/min，离心10min，弃去上清液，取沉淀均匀涂片烘干，置于显微镜下观察。

1.3.3 消化时间实验

用强酸消化法、酶消化法、酶消化联合强酸消化法分别消化5g肺、肝、肾组织，至溶液澄清透明为完全消化，记录各自完全消化所需要的时间。

1.3.4 消化能力实验

用上述3种方法分别将5 g肺、肝、肾组织消化2h，称取消化后剩余固体残渣的质量。

1.3.5 硅藻检出率实验

用上述3种方法分别消化5g肺、肝、肾组织，至溶液澄清透明，离心后弃去上清液，取沉淀涂片烘干，显微镜下观察硅藻形态并计数。分别取40例的现场水样各10mL，以离心半径6cm，2500 r/min，离心10min，弃去上清液，取沉淀均匀涂片烘干，显微镜下观察硅藻形态并计数。

1.3.6 硅藻检测定量分级

按照整张载玻片检见的硅藻数量对结果进行评判：大量（++++），＞60个；中量（+++），30～60个；少量（++），10～30个；极少量（+），1～10个；未见（-），0个。

1.3.7 统计学分析

2 结果

2.1 消化时间的比较

3种消化法将5g肺、肝、肾组织完全消化所需要的时间见表1。结果表明，强酸消化法消化时间最短，酶消化联合强酸消化法次之，酶消化法时间最长。3种方法消化时间两两比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 3种消化法对肺、肝、肾组织的消化时间比较（n=40，±s，min）

表1 3种消化法对肺、肝、肾组织的消化时间比较（n=40，±s，min）

注：1）与强酸消化法比较，P＜0.05；2）与酶消化联合强酸消化法比较，P＜0.05

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2.2 消化能力的比较

3种消化法在规定的时间（2 h）内将5 g肺、肝、肾组织消化后剩余的残渣质量见表2。结果表明，强酸消化法消化能力最强，酶消化联合强酸消化法次之，酶消化法最差。3种方法消化能力两两比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 3种消化法对肺、肝、肾组织消化后剩余残渣质量的比较（n=40，±s，mg）

表2 3种消化法对肺、肝、肾组织消化后剩余残渣质量的比较（n=40，±s，mg）

注：1）与强酸消化法比较，P＜0.05；2）与酶消化联合强酸消化法比较，P＜0.05

2.3 硅藻检出率的比较

2.3.1 3 种方法的硅藻检验结果

3种方法对40例溺死尸体的肺、肝、肾组织硅藻检验数量和硅藻检出率见表3。结果表明，（1）强酸消化法在肺、肝、肾组织中检出硅藻数量达中量以上的分别为17例（42.5%）、3例（7.5%）、2例（5.0%），酶消化联合强酸消化法在肺、肝、肾组织中检出硅藻数量达中量以上的分别为34例（85.0%）、12例（30.0%）、7例（17.5%），酶消化法在肺、肝、肾组织中检出硅藻数量达中量以上的分别为36例（90.0%）、13例（32.5%）、9例（22.5%）；酶消化联合强酸消化法检出硅藻数量达中量以上的明显多于强酸消化法。（2）肺、肝、肾组织中硅藻检出率最高的是酶消化法，其次是酶消化联合强酸消化法，最低的是强酸消化法。（3）肺、肝、肾3种组织中，肺的硅藻检出率最高。

2.3.2 现场水样的硅藻检验结果

40例现场水样中均检出硅藻，其中硅藻检出数量达大量的有36例，达中量的有3例，还有1例检出极少量硅藻，该例现场水样为井水。

表3 3种方法中各组织的硅藻检验结果（N=40，例）

2.4 硅藻检出种类的比较

3种方法消化肺、肝、肾组织后检出的硅藻种类及现场水样中检出的硅藻种类见表4。结果表明，强酸消化法检出硅藻种类较现场水样少，酶消化联合强酸消化法和酶消化法检出的硅藻种类与现场水样基本一致。

表4 硅藻种类检验结果

3 讨论

在法医学鉴定实践中，理想的硅藻检验方法是操作简单、安全、环境污染小，所需设备和试剂经济、便宜，消化时间短，硅藻检出率高。传统方法中强酸消化法、酶消化法是目前国内基层法医检验硅藻的主要方法，也是具有代表性的两种硅藻检验方法。梁新华等[7]通过对强酸消化法和胰蛋白酶消化法检验器官硅藻的比较研究结果表明，强酸消化法消化时间短、消化能力强，但硅藻检出率低，并且存在硝酸喷出会灼伤人体、反应过程中释放的二氧化氮会污染环境等缺点；胰蛋白酶消化法操作简单安全，所需设备少，对人体和环境造成的危害也较小，最重要的是硅藻检出率较高，但此法消化所需时间较长，不适合紧急案件的侦办。

近几年研发的硅藻检验新方法有DNA检测法、微波消解-扫描电镜联用法等，DNA检测法的优点是具有极高的灵敏度和特异性，同时能排除腐败菌的干扰；微波消解-扫描电镜联用法采用真空抽滤法富集硅藻，可最大程度避免硅藻损伤，提高了硅藻的回收率。但此两种方法都存在操作复杂、所需仪器和试剂昂贵、对实验室清洁和操作过程中防污染的要求严格等问题，目前条件下，该两种方法在基层办案单位中推广应用受到限制。

本研究对强酸消化法、酶消化法、酶消化联合强酸消化法3种检验方法分别进行了消化时间、消化能力、硅藻检出率等方面的比较。实验结果显示，在消化时间、消化能力上，酶消化联合强酸消化法明显优于酶消化法；在硅藻检出率上，酶消化联合强酸消化法优于强酸消化法；在检出的硅藻种类上，酶消化联合强酸消化法多于强酸消化法。酶消化联合强酸消化法是在酶前期对组织器官消化到一定程度的基础上再加入少量的强酸联合消化，该方法在消化过程中引入了破机能力强的强酸，与单纯酶消化相比较，消化时间减少，消化能力增加，提高了办案效率。由于该方法只加入少量的强酸，避免了强酸消化法中因使用大量强酸对耐酸性差的有机硅藻的破坏，提高了硅藻检出率，同时也避免了使用大量强酸对操作者的危险性和对环境的危害性。此法结合了强酸消化法和酶消化法的优点，同时弥补了各自的不足，在实践中既适合紧急案件的侦办，也适合水体中硅藻含量低的案件检验，有一定的推广和实践价值。

[1]孙丞辉，王彪，李正东，等.溺水尸体硅藻检验的研究进展[J].法医学杂志，2015，31（6）：462-465.

[2]赵子琴.法医病理学[M].第4版.北京：人民卫生出版社，2009：323-328.

[3]何方刚，刘良，黄代新，等.浮游生物16S rDNA检测在大鼠溺死鉴定中的价值[J].中国法医学杂志，2006，21（6）：331-333.

[4]李向阳，赵建，刘超，等.溺死及死后入水兔肺组织中硅藻分布[J].法医学杂志，2014，30（2）：81-84，87.

[5]胡孙林，温锦锋，赖文彬，等.M icro-XRF法检测肺内抗酸性硅质颗粒及其在溺死诊断中的应用[J].法医学杂志，2010，26（4）：257-259.

[6]苏会芳，刘超，胡孙林，等.微束X射线荧光光谱分析在法医学鉴定中的应用进展[J].法医学杂志，2013，29（1）：43-48.

[7]梁新华，焦炎，丰荣平，等.强酸消化法和胰蛋白酶消化法检验腐败脏器硅藻的比较研究[J].刑事技术，2008，（4）：7-9.

[8]中华人民共和国公安部.人体组织器官中硅藻硝酸破机法检验：GA/T 813—2008[S].2009.

[9]何冠英，张维东，李飞，等.酶消化法检验脏器硅藻[J].中国法医学杂志，2003，18（3）：171-172.

Diatom Detection Using Enzyme Combined w ith Strong Acid Digestion M ethod

YAO Jian,KAN Wei-jun
（Institute of Forensic Science,Nantong Public Security Bureau,Nantong 226007,China）

ObjectiveTo detect diatom in the organs of drowners by enzyme combined w ith strong acid digestion method,and evaluate its application value.MethodsA total of 40 cases which have been identified as drowning in local region were collected.Samples of the lung,liver,kidney,and the water of the scene were also gathered from each case.Strong acid digestion method,enzyme combined w ith strong acid digestion method,and enzymic digestion method were respectively performed to detect the diatom in the samples.The comparative analysis was made on digestion time,digestive power and detection rate of diatom,etc.ResultsEnzyme combined w ith strong acid digestion method was significantly better than enzym ic digestion method on digestion time and digestive power;enzyme combined w ith strong acid digestion method were obviously superior to strong acid digestion method on the detection rate of diatom.ConclusionEnzyme combined w ith strong acid digestion method combines the advantages of strong acid digestion method and enzymic digestion method.It has the characters of operation safety w ith little pollution to environment,which is worthy of further popularization and practice.

forensic pathology;drowning;diatom;strong acid digestionmethod;enzymatic digestionmethod

DF795.1

：A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.02.012

1004-5619（2017）02-0165-03

2016-05-13）

（本文编辑：张建华）

姚建（1981—），男，主检法医师，主要从事法医病理学和法医临床学鉴定；E-mail：nantongyaojian@163.com