大鼠肌肉挥发性有机化合物变化规律与死亡时间的关系

刘蓓蓓，夏志远，马锦琦，李朴，吕坪，周海梅

（河南科技大学法医学院，河南洛阳 471003）

·论著·

大鼠肌肉挥发性有机化合物变化规律与死亡时间的关系

刘蓓蓓，夏志远，马锦琦，李朴，吕坪，周海梅

（河南科技大学法医学院，河南洛阳 471003）

目的探究大鼠死后肌肉挥发性有机化合物（volatile organic compound，VOC）的变化规律与死亡时间（postmortem interval，PMI）的关系。方法健康大鼠120只，随机分成12组，每组10只，以颈椎脱臼方式处死后保存在（25±1）℃环境中，在死后即刻（0d）、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10d共12个时间点分别取一组大鼠肌肉，采用顶空固相微萃取气质联用法收集、检测、分析大鼠肌肉VOC。结果共鉴定出15种VOC，其中芳香类9种、含硫类3种、脂肪酸类2种、杂环类1种。随PMI延长，VOC种类总数呈增加趋势，第1天没有检测到VOC，第2天检出3种，第3天检出9种，第4天检出11种，5～7 d检出14种，8～10d检出15种。不同VOC峰面积与PMI存在一定的相关性（校准R2=0.15～0.96），15种VOC总峰面积（y）与PMI（x）相关：2～5d，回归方程为y=-17.05x2+164.36x-246.36（校准R2=0.96）；6～10d回归方程为y=2.24x+101.13（校准R2=0.97）。结论肌肉VOC变化规律有助于PMI的推断。

法医病理学；挥发性有机化合物；气相色谱-质谱法；固相微萃取；死亡时间；肌；大鼠

死亡时间（postmortem interval，PMI）推断是法医病理学研究的难点问题之一，寻找客观、准确的PMI推断方法是法医学者的重要任务。目前，利用尸体组织内蛋白质、核酸等时序性变化规律及昆虫数据推断PMI，是当前研究的热点[1，2]。然而，尸体腐败影响因素较多，组织内成分复杂，寻找更多的研究指标和方法，是最终建立多指标、多因素PMI推断模型的重要基础。

随着各种大型精密分析仪器的发明和使用，对各种化学成分进行定性、定量检测已经成为可能，其中气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）可以实现对复杂有机化学组分进行有效的分离、定性及定量检测，因此已经被广泛应用于毒（药）物成分的检测、中药成分的分析、食品特征风味成分的研究等领域。法医学研究表明，机体死亡后，尸体组织中的蛋白质、核酸、脂肪等大分子物质在细菌和酶的作用下，会产生大量可以被GC-MS检测到的挥发性有机化合物（volatile organic compound，VOC），如芳香类、含有机硫类、有机酸、酯、醛、酮类等成分，由于一些特征VOC通常由尸体腐败分解而来，因此VOC的检测常用于确定或提示隐匿尸体的埋藏地点[3，4]。而食品科学研究数据表明，肉组织中产生的VOC与肉的放置时间存在显著的相关性，即随着存放时间的延长，肉组织中VOC的种类和含量将会持续增加[5-8]。因此，食品科学可以通过检测肉类的VOC来鉴定肉类的新鲜程度。

尸体肌肉的腐败与食品肉类变质机制相似，因此尸体肌肉VOC的时序性变化有可能成为PMI推断的另一种方法。本研究利用顶空固相微萃取-气质联用法（head space-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GCMS）提取、检测、分析恒温下不同PMI大鼠肌肉VOC种类和含量变化，初步探究尸体肌肉VOC的产生与变化规律及其与PMI的关系。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和设备

GC-MS（HP6890A-5973N，美国Agilent公司），萃取纤维头（50/30μm DVB/CAR/PDMS，美国SUPELCO公司），电子分析天平（OHAUSDiscovery，美国OHAUS公司）。

1.2 实验动物分组与处理

健康SD大鼠120只，雌雄不限，体质量（240± 30）g，随机分成12组，每组10只。以颈椎脱臼方式处死大鼠，大鼠放置于泡沫箱内，用薄层透气丝绸封口。将装有大鼠的泡沫箱放置于温度（25±1）℃、湿度（45±5）%环境下保存。于死后即刻（0 d）、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d分别取一组大鼠进行操作。

1.3 肌肉VOC提取与检测

1.3.1 HS-SPME

取每只大鼠后肢肌肉，去除脂肪和筋膜，并精确称取2.000g，剪碎后移入50mL顶空瓶内。将顶空瓶置于55℃中水浴并平衡20min后，将老化后的萃取纤维头插入顶空瓶内（插入长度4 cm），在55℃下吸附20min。将纤维头收回，插入GC-MS进样口，解析2min，对萃取成分进行检测分析。进行下一次样本检测前，纤维头在进样口内250℃解析10min，以消除不同样品产物之间的影响。

1.3.2 GC-MS分析

GC条件色谱柱：HP-5MS（30m×0.25mm，0.25μm）弹性石英毛细管柱。升温程序设置为起始温度45℃，以10℃/min升温至85℃，再以5℃/min升温至130℃；以2.5℃/min升温至135℃；再以10℃/min升温至230℃，保持8min。进样口温度250℃，载气（He）流速1.0mL/min，进样方式选择不分流。解析时间为2min。

MS条件：EI源能量70 eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，接口温度250℃，扫描范围15～380amu。

定性和定量分析：通过NIST谱库结合人工解析确定每种VOC的名称、分子式及分子量。采用手动积分方法进行峰面积计算，以3次计算结果平均值作为该物质峰面积最终结果。

1.4 数据处理

以PMI为自变量（x），以每种VOC为因变量（y），分析不同种VOC与PMI的相关性；绘制VOC种类总数随PMI变化的关系图。以PMI为自变量（x），15种VOC总峰面积为因变量（y），分析VOC总峰面积与PMI的相关性。绘图及分析过程均由OriginPro 8.0（美国OriginLab公司）完成。

2 结果

25℃环境下，大鼠死后10 d内，共检出15种VOC，结果见表1，其中芳香类9种，包括苯甲醛、苯酚、对甲基苯酚、苯乙胺、苯乙醇、吲哚、苯丙酸乙酯、3-甲基吲哚和苯亚甲基苯乙胺；含硫类3种，包括二甲基二硫、二甲基三硫和epsilon-硫代己内酰胺；小分子脂肪酸类2种，分别为丁酸和4-甲基戊酸；杂环类1种，为2-哌啶酮。15种VOC中，吲哚、对甲基苯酚、二甲基二硫、二甲基三硫及2-哌啶酮平均峰面积较大，说明这几种物质含量相对较高。

芳香族VOC峰面积随PMI变化见表2，其中吲哚、对甲基苯酚从第2天开始出现，苯甲醛、苯乙醇、苯丙酸乙酯从第3天开始出现，苯酚第4天开始出现，3-甲基吲哚、苯亚甲基苯乙胺第5天开始出现，苯乙胺第8天开始出现。总体而言，芳香类VOC种类逐渐增多。

其他类VOC峰面积随PMI变化见表3。二甲基三硫第2天开始出现，二甲基二硫、4-甲基戊酸、2-哌啶酮第3天开始出现，丁酸第4天开始出现，epsilon-硫代己内酰胺第5天开始出现。

15种VOC峰面积随PMI回归方程结果如表4，校准R2在0.15～0.96。

大鼠死后肌肉VOC种类变化与PMI的关系结果如图1，1d内无VOC，2～5d VOC种类显著增多，6～10d VOC种类也有增加，但增加数目较上一阶段少。

大鼠死后肌肉15种VOC总峰面积（y）随PMI（x）变化如下：2～5 d总峰面积日增加量为3.5×106左右，二者的回归方程为y=-17.05x2+164.36 x-246.36，校准R2=0.96；6～10 d总峰面积日增加量为1.0×106左右，二者关系的回归方程为y=2.24x+101.13，校准R2=0.97。

表1 大鼠死后肌肉VOC总表

表2 芳香类VOC峰面积随PMI变化（n=10，±s，×105）

表2 芳香类VOC峰面积随PMI变化（n=10，±s，×105）

注：“-”表示未检出

?

表3 其他类VOC峰面积随PMI变化（n=10，±s，×105）

表3 其他类VOC峰面积随PMI变化（n=10，±s，×105）

注：“-”表示未检出

?

表4 不同种VOC峰面积（y）随PMI（x）变化的回归方程

图1 大鼠肌肉VOC种类变化与PMI的关系

3 讨论

目前，利用各种精密仪器检测尸体组织内大分子物质含量的时间依赖性变化规律，是PMI推断研究的热点方法之一[9-11]。GC-MS具有高分辨率和高灵敏度，可以实现对复杂组分的分离和鉴定。而HS-SPME是集采样、萃取、浓缩、进样于一体的无需溶剂的样品微萃取技术，具有操作简单、便于携带、萃取率高等特点，是样品前处理最先进的技术之一。因此，将HSSPME与GC-MS联用，在分析尸体腐败后组织VOC变化方面具有一定的优势。

食品肉类VOC变化规律与放置时间的相关性已经初步得到证实。一般认为，这些VOC主要是组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的降解产物，芳香类及含氮、含硫物质多为蛋白质降解产生，而有机酸、醛、酮、酯类多与脂肪和糖类降解有关[12]。微生物学进一步研究[13，14]表明，VOC种类与菌属之间存在着一定的对应关系，不同的VOC提示有不同菌种的存在，如吲哚提示有大肠埃希菌的存在，二甲基三硫提示有绿脓杆菌和金黄葡萄球菌的存在，丁酸则提示有葡萄球菌的存在等。从这一角度，肉类VOC种类的变化，理论上与优势菌群变化（或细菌群落演替）有关，而细菌群落的变化又与肉组织内营养物质消耗、pH值改变、代谢物质的积累等因素有关。

本研究利用HS-SPME-GC-MS法检测了25℃下不同PMI大鼠肌肉的VOC。考虑到脂肪液化较快及后期定量困难等问题，本实验仅以肌肉组织作为研究对象。本实验将大鼠放置于用透气丝绸封口的泡沫箱内，以消除蝇蛆等昆虫代谢产物对检测结果的干扰。将大鼠肌肉剪碎、适当提高平衡温度，可以加快气体挥发的速度，从而提高了检测效率。选择复合型纤维头（50/30μm DVB/CAR/PDMS），主要考虑其可以萃取较宽分子量范围的组分，且该种纤维头所得结果具有重现性高、变异系数低等优点。同时，实验过程中，严格控制了平衡温度、平衡时间、萃取时间、解析时间及萃取头洗涤时间等，以保证实验结果的可靠性。

本研究共鉴定出15种特征性VOC，与日本学者[15]所研究的猪死后体表VOC种类数目相比，本实验除了检测到相同种类的硫醚类物质外，还检测到更多种类的芳香类物质，如3-甲基吲哚、苯丙酸乙酯、苯亚甲基苯乙胺等，但检测到的酸、酮、醇类物质较少。出现上述差异的可能原因是，本实验没有将脂肪作为研究对象，从而所检测到的脂肪降解产物酸、醇、酮类物质较少。而检测到较多的芳香类VOC则与本实验中肌肉的前处理方法及萃取方式有关。与食品科学肉类腐败VOC相比，本实验VOC种类检测结果有一定差异。造成这种差异可能原因有，食品肌肉暴露于有氧环境中，受外界环境细菌影响较大，而尸体肌肉受皮肤保护，则处于相对无氧环境，细菌多来源于肠道。此外，检测结果也与萃取方法等因素有关。

本研究表明，大鼠肌肉VOC变化与PMI存在一定的相关性。首先，每一种VOC与不同PMI区段相对应，而结合所有种类VOC变化可将PMI区段进一步划分。第二，不同种类VOC峰面积与PMI均有一定的相关性（校准R2=0.15～0.96），但通过15种VOC总峰面积推断PMI推断更有优势（校准R2=0.96～0.97）。然而，综合运用VOC总峰面积和种类总数的变化规律推断PMI结果更有意义。具体来说，大鼠死后肌肉VOC的种类数和总峰面积随PMI延长均呈现阶段性变化规律：1 d内，未检测到VOC；2～5 d，VOC种类总数随PMI快速增加，峰面积日增加量较大（3.5×106左右）；6～10 d，VOC种类数随PMI增加速度变慢，峰面积日增加量变小（1.0×106左右）。而大鼠肌肉VOC的阶段性变化规律，与微生物学细菌总数生长曲线规律、法医学尸体腐败大致分期以及大鼠死后肌肉挥发性盐基总氮（TVB-N）含量等变化规律基本一致[16，17]。传统涉及多个分子指标的PMI研究中，当指标不能进行多元线性回归时，常无法给出多个指标的回归方程。而本研究采取了将指标种类（VOC种类）改变与指标总含量（VOC总峰面积）变化相结合的PMI推断方法，初步给出了依据多指标的PMI推断模型。因此，该法对于其他多分子指标的PMI研究也具有一定的借鉴意义。

[1]陶丽，马剑龙，陈龙.早期死亡时间推断研究进展[J].法医学杂志，2016，32（6）：444-447.

[2]Li C，Wang Q，Zhang Y，et al.Research progress in the estimation of the postmortem interval by Chinese forensic scholars[J].Forensic Sci Res，2016，1（1）：3-13.

[3]Perrault KA，Stefanuto PH，Stuart BH，et al. Detection of decomposition volatile organic compounds in soil follow ing removal of remains from a surface deposition site[J].Forensic Sci Med Pathol，2015，11（3）：376-387.

[4]Stefanuto PH，Perrault KA，Stadler S，et al.GC× GC-TOFMS and supervised multivariate approaches to study human cadaveric decomposition olfactive signatures[J].Anal Bioanal Chem，2015，407（16）：4767-4778.

[5]马瑜璐，朱斌，张雷，等.顶空固相微萃取-气质联用检测猪肉新鲜度[J].食品科学，2011，32（14）：253-256.

[6]王小占，柴春祥.猪肉腐败过程中挥发性成分的测定[J].食品科技，2012，37（3）：148-152.

[7]朱斌，马瑜璐，张雷，等.质谱法评价猪肉新鲜度[J].食品安全质量检测学报，2012，3（1）：40-44.

[8]朱瑶迪，邹小波，黄晓玮，等.猪肉贮藏过程中挥发性成分的研究[J].食品工业科技，2012，33（24）：374-378.

[9]黄平，黎世莹，李正东，等.傅里叶显微红外光谱成像技术研究进展及其法医学应用[J].法医学杂志，2011，27（6）：447-450.

[10]潘晖，张恒，吕叶辉，等.不同温度下大鼠皮肤5种RNA指标与PM I的相关性[J].法医学杂志，2014，30（4）：245-249.

[11]蒯锦霞.大鼠死后心肌和肺脏微管蛋白降解与死亡时间的相关性研究[D].太原：山西医科大学法医学院，2014.

[12]王小占.基于电子鼻的猪肉新鲜度检测体系的研究[D].天津：天津商业大学，2012.

[13]Bos LD，Sterk PJ，Schultz MJ.Volatile metabolites of pathogens：a systematic review[J].PLoS Pathog，2013，9（5）：e1003311.

[14]Boots AW，Smolinska A，van Berkel JJ，et al. Identification of microorganisms based on headspace analysis of volatile organic compounds by gas chromatography-mass spectrometry[J].J Breath Res，2014，8（2）：27106.

[15]Paczkowski S，Nicke S，Ziegenhagen H，et al. Volatile em ission of decomposing pig carcasses（Sus scrofa domesticus L.）as an indicator for the postmortem interval[J].J Forensic Sci，2015，60（S1）：130-137.

[16]夏志远，翟仙敦，刘蓓蓓，等.大鼠肌肉电导率与腐败程度的关系[J].法医学杂志，2017，33（1）：17-20.

[17]夏志远，翟仙敦，刘蓓蓓，等.大鼠肌肉电导率测定与死亡时间的推断[J].中国法医学杂志，2015，30（6）：574-578.

Relationship between the Change Rules of Volatile Organic Com pounds in Rat M uscle and Postmortem Interval

LIU Bei-bei,XIA Zhi-yuan,MA Jin-qi,LI Pu,LÜPing,ZHOU Hai-mei
（School of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China）

ObjectiveTo explore the relationship between the change rules of volatile organic compounds（VOCs）in rat muscle and postmortem interval（PM I）.MethodsA total of 120 healthy rats were divided random ly into 12 groups（10 for each group）.After the rats were sacrificed by cervical dislocation,the bodies were kept at（25±1）℃.Ratmuscle samples were separately obtained at 12 PM I points,including 0,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9 and 10 d.The VOCs in rat muscles were collected,detected and analyzed by headspace solid-phase m icroextraction（HS-SPME）coupled to gas chromatography-mass spectrometer（GC-MS）.ResultsIn total,15 species of VOCs were identified,including 9 aromatic compounds,3 sulfur compounds,2 aliphatic acids and 1 heterocyclic compound.The species of VOCs increased w ith PM I：no species were detected w ithin 1 day,3 species were detected on day 2,9 on day 3,11 on day 4,14 from day 5 to 7,and 15 from day 8 to 10.Total peak area of 15 species of VOCs was significantly correlated to PM I（adjusted R2=0.15-0.96）：the regression function was y=-17.05 x2+ 164.36 x-246.36（adjusted R2=0.96）from day 2 to 5,and y=2.24 x+101.13（adjusted R2=0.97）from day 6 to 10.ConclusionThe change rules of VOCs in rat muscle are helpful for PM I estimation.

forensic pathology;volatile organic compounds;gas chromatography-mass spectrometry;solid phase m icroextraction;postmortem interval;muscles;rats

DF795.1

：A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.02.003

1004-5619（2017）02-0120-05

2016-01-27）

（本文编辑：邹冬华）

河南省教育厅重点科研基金资助项目（16A150030）；河南科技大学研究生创新基金资助项目（CXJJ-ZR22）

刘蓓蓓（1989—），女，硕士研究生，主要从事法医毒物分析的研究；E-mail：legal-medicine@qq.com

周海梅，女，教授，主要从事法医毒物分析教学与研究；E-mail：lyzhouhm@haust.edu.cn