华夏TM白金PCR 扩增试剂盒的法医学应用评估

王亚丽，盛翔，李敏，陈玉玲，林源，陈丽琴

（1.内蒙古医科大学法医学教研室，内蒙古呼和浩特 010030；2.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；3.苏州大学医学部法医学系，江苏苏州 215123；4.温州医科大学基础医学院，浙江温州 325000；5.华东理工大学生物工程学院生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）

·论著·

华夏TM白金PCR 扩增试剂盒的法医学应用评估

王亚丽1，2，盛翔2，3，李敏2，4，陈玉玲2，5，林源2，陈丽琴1

（1.内蒙古医科大学法医学教研室，内蒙古呼和浩特 010030；2.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；3.苏州大学医学部法医学系，江苏苏州 215123；4.温州医科大学基础医学院，浙江温州 325000；5.华东理工大学生物工程学院生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）

目的调查华夏TM白金PCR扩增试剂盒所包含的23个常染色体STR基因座在中国汉族人群中的遗传多态性，评估其在法医遗传学中的应用价值。方法应用华夏TM白金PCR扩增试剂盒对500名汉族无关健康个体进行分型检测，统计分析所含STR基因座的频率分布及群体遗传学参数，与目前国内外常用的7种商品化试剂盒在STR基因座个数、内标、荧光标记、Ladder中等位基因总数以及系统效能上进行比较。结果23个常染色体STR基因座均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），个体识别率为0.791 5～0.986 2，多态信息含量为0.559 0～0.914 0。系统累积个体识别率高达1-4.1×10-28，三联体累积非父排除率为1-4.1×10-10，二联体累积非父排除率为1-8.4×10-7。通过与7种试剂盒比较，华夏TM白金PCR扩增试剂盒含有的等位基因分型标准品（Ladder）中的等位基因数最多。结论23个常染色体STR基因座在汉族人群中有良好的遗传多态性，可用于法医遗传学亲权鉴定及个体识别。通过与其他常见的7种商业化STR检测试剂盒比较，华夏TM白金PCR扩增试剂盒可进一步提供更为丰富的遗传信息。

法医遗传学；短串联重复序列；多态现象，遗传；华夏TM白金PCR扩增试剂盒；汉族

短串联重复序列（short tandem repeat，STR）是核心序列为2～7个碱基组成的短串联重复结构。20世纪90年代，STR基因座第一次在人类亲权鉴定中作为一种重要的遗传标记出现[1]。第一个STR复合扩增的试剂盒由英国的法庭科学服务部（Forensic Science Service，FSS）研制，包括TH01、vWA、FES/FPS和F13A1四个基因座[1]。随着人类基因组计划的完成，对染色体上STR基因座的筛选更为快速、方便，商业化的STR检测试剂盒陆续出现。常用的商业化STR检测试剂盒主要包括美国Thermo Fisher公司推出的Identifier、GlobalFiler以及针对中国人群设计的Sinofiler、华夏系列试剂盒等，美国Promega公司研发的PowerPlex系列试剂盒；国产试剂盒常用的有基点认知技术（北京）有限公司推出的Golden e ye系列试剂盒，公安部物证鉴定中心研制的Typer系列试剂盒，以及无锡中德美联生物技术有限公司推出的AGCU系列试剂盒等。

目前，华夏TM白金PCR扩增试剂盒是美国Thermo Fisher公司推出的新一代六色荧光STR检测试剂盒，共包含25个基因座，其中涵盖了美国联邦调查局（Federal Bureau of Investigation，FBI）于2017年1月1日强制要求的CODIS全部核心基因座[2-4]，同时包含了我国公安部国家DNA数据库常见的21个基因座。本研究通过对该试剂盒中所包含的23个常染色体STR基因座在汉族人群中的分布频率、群体遗传学参数和连锁不平衡情况的调查，并与文献中所获取的国内外7种常用商业化STR检测试剂盒（Identifier、Sinofiler、GlobalFiler、PowerPlex 21、Golden e ye 20A、Typer 15 Plus、AGCU 17+1）的群体遗传学参数进行比较，评估该试剂盒的法医遗传学应用价值。

1 材料与方法

1.1 样本

本研究的样本来源于500名中国汉族健康无关个体，其中男性250名，女性250名，均为FTA卡血样。以上样本的采集和使用均获得志愿者的知情同意。

1.2 主要试剂与仪器

华夏TM白金PCR扩增试剂盒、标准品007和GeneScanTM600 LIZ v2.0分子量内标均购自美国Thermo Fisher公司。

0.5 mm/1.2mm孔径打孔器购自美国Harris公司，9700型PCR扩增仪、3500xl型基因分析仪均购自美国Thermo Fisher公司。

1.3 PCR扩增和STR分型

用0.5mm/1.2mm孔径打孔器进行打孔取样，血样直接打入预先准备好的洁净96孔反应板底部。采用12.5μL标准反应体系对23个常染色体STR基因座（D3S1358、vWA、D16S539、CSF1PO、TPOX、D8S1179、D21S11、D18S51、Penta E、D2S441、D19S433、TH01、FGA、D22S1045、D5S818、D13S317、D7S820、D6S1043、D10S1248、D1S1656、D12S391、D2S1338和Penta D）和Amelogenin以及1个Y-InDel位点进行PCR扩增。体系组成包括反应混合物5μL，引物组5μL，去离子水2.5μL。采用标准品007作为阳性对照。

PCR条件：95℃1min预变性；94℃3 s，59℃16 s，65℃29 s，27个循环；60℃5min；4℃保温。加热模式设为“Max”。扩增好的PCR产物变性后在3500xl型基因分析仪上进行毛细管电泳，用GeneMapper®ID-X软件对STR基因座进行分型。

1.4 统计分析

应用Modified-Powerstates[5]和Cervus v3.0.7[6]软件对23个常染色体STR基因座进行Hardy-Weinberg平衡检验，并完成等位基因分布频率、个体识别率（DP）、多态信息含量（PIC）、观察杂合度（Ho）及期望杂合度（He）的计算。采用Arlequin软件完成STR基因座之间连锁不平衡分析。参照文献[7]公式计算三联体非父排除率（PET）、二联体非父排除率（PED）、三联体累积非父排除率（CPET）、二联体累积非父排除率（CPED）、累积个体识别率（CDP）。

通过查阅文献资料[8-13]，得到国内外常见的7种商业化STR检测试剂盒的基本信息，并与华夏TM白金试剂盒在STR基因座个数、内标、荧光标记、Ladder中等位基因总数以及系统效能（CPE和CDP值）上进行比较。

2 结果

2.1 基因分型及等位基因分布情况

华夏TM白金PCR扩增试剂盒推荐的PCR扩增体系为25μL，在本研究中，尝试采用12.5μL的扩增体积对标准品007进行PCR扩增和电泳检测，电泳分型图谱准确。

23个常染色体STR基因座的基本遗传信息见表1，试剂盒中分型标准物图谱见图1，其中含有等位基因数为356个。本次在500名个体中共检出279个等位基因，其中Penta E检出的最多，为23个，TPOX和TH01最少，均为6个，等位基因频率分布见表2。

2.2 群体遗传学参数

经χ2检验，500名中国汉族健康无关个体在23个STR基因座上均符合Hardy-Weinberg平衡检验（P＞0.05）。群体遗传学参数见表3，其中DP为0.7915～0.9862，PIC为0.5590～0.9140，Ho为0.6214～0.920 6，PET为0.360 4～0.837 1。经Arlequin软件分析，各STR基因座之间相互独立，采用乘积原则计算，CPET为1-4.1×10-10，CPED为1-8.4×10-7。

2.3 商业化STR检测试剂盒系统效能比较

8个商业化STR检测试剂盒的STR基因座个数、内标、荧光标记、Ladder中等位基因总数见表4。各试剂盒的系统效能比较见表5，其中华夏TM白金试剂盒的CPE值和CDP值最高，分别为1-4.1×10-10和1-4.1×10-28。Identifier试剂盒的CPE值和CDP值最低，分别为1-1.3×10-6和1-1.5×10-17。

表1 华夏TM白金PCR扩增试剂盒中23个STR基因座的基本遗传信息

图1 华夏TM白金PCR扩增试剂盒中等位基因分型标准物图谱

表2 23个常染色体STR基因座的等位基因频率分布（n=500）

续表2

表3 23个常染色体STR基因座的群体遗传学参数（n=500）

表4 8种常见商业化STR检测试剂盒的基本信息

表5 8种常见商业化STR检测试剂盒的系统效能对比

3 讨论

目前，国内外常用的商业化STR检测试剂盒有多种，其中美国Thermo Fisher公司先后推出的采用五色荧光技术的Identifier和Sinofiler试剂盒在中国市场应用广泛，均包含15个常染色体STR基因座和Amelogenin，其不同之处在于Sinofiler试剂盒是针对中国人群开发，将Identifier试剂盒中在中国人群中鉴别能力较差、多态性较低的TPOX和TH01两个基因座替换成D12S391和D6S1043[14]。2012年Thermo Fisher公司推出突破性六色荧光标记技术、含有24个STR基因座的GlobalFiler PCR扩增试剂盒，其中包含FBI最新公布的20个CODIS核心基因座［即1997年FBI建立的13个CODIS基因座（CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX、vWA）以及增加的7个基因座（D1S1656、D2S441、D2S1338、D10S1248、D12S391、D19S433、D22S1045）］。同年，美国Promega公司也推出了PowerPlex 21试剂盒，该试剂盒整合了Identifier、Sinofiler以及PowerPlex 16三种试剂盒所包含的全部STR基因座，再加上D1S1656，即13个CODIS核心基因座加上D1S1656、D2S1338、D12S391、D19S433、D6S1043、Penta E和Penta D这7个STR基因座。国产化试剂盒Golden e ye 20A是基点认知技术（北京）有限公司研发的一款试剂盒，与PowerPlex 21试剂盒相比，减少了1个STR基因座D1S1656。Typer 15 Plus试剂盒是由公安部物证鉴定中心研制推行，其在Typer 15的基础上又增加了4个基因座（TH01、TPOX、D12S391、D19S433），该试剂盒既保留了足够的通用STR基因座，便于DNA数据的交流和共享，同时选择了更适合中国人群的一些新的基因座，大大提高了其实用性。可对18个基因座进行同步扩增的AGCU 17+1试剂盒是由无锡中德美联生物技术有限公司研发，其在Typer 15的基础上少了1个基因座D12S391。本研究中的华夏TM白金PCR扩增试剂盒是美国Thermo Fisher公司针对中国人群开发的试剂盒，在GlobalFiler试剂盒的基础上增加了在中国人群中多态性高的D6S1043、Penta E和Penta D，删掉了SE33和DYS391两个基因座。

Gill等[15]认为DP＞0.9、H＞0.7是高度鉴别能力的基因座。人类基因定位第11次国际会议标准[16]指出，PIC≥0.6属于高多态性基因座。本次检测数据表明，除D3S1358、CSF1PO、TPOX和TH01基因座外，其余基因座DP值均大于0.9；除TPOX外，其余基因座PIC值均大于0.6；除D3S1358、TPOX、TH01外，其余基因座PET值均在0.5以上；除TPOX和TH01外，其余基因座Ho均大于0.7。以上统计结果显示，Penta E的DP（0.9862）、PIC（0.9140）、PET（0.8371）、Ho（0.9206）值均最高，TH01、TPOX的效能最低，这与文献[8]中提到的TH01、TPOX在中国人群中的多态性较差相符合。

当分型标准品的基因座等位基因未包含检测样本的等位基因时，则表示出现新的等位基因，需要自己定义，在实践中称这些为“off-ladder”等位基因或“OL”基因[1]，即稀有等位基因。其包括两种情况[17]，一种是在基因座Ladder最大和最小等位基因内，另一种是超过基因座Ladder范围位于两个邻近基因座Ladder之间。因此，Ladder中等位基因分型的完善，意味着该试剂盒在自动分型上更全面、准确、方便。由于华夏TM白金PCR扩增试剂盒是在GlobalFiler试剂盒基础上研发的，在重叠的21个基因座中，这两个试剂盒中Ladder的等位基因分型一致。综合分析8种商业化试剂盒，其中PowerPlex 21试剂盒在D1S1656、D5SD818、D6S1043、D7S820、D13S317、D16S539、TPOX、TH01、FGA、D12S391、D21S11、vWA以及CSF1PO基因座所含有的等位基因最为丰富；Goldene ye 20A试剂盒在Penta E、D12S391、D21S11、vWA基因座以及Typer 15 Plus试剂盒在D19S433基因座的等位基因分型最全面。

本研究中共发现11个稀有等位基因，包括Penta E（17.4，19.4，25）、D19S433（11.2，14.3）、FGA（24.1）、D6S1043（17.3，18.2，22.3）、D1S1656（15.1）、D12S391（18.3）。其中，除D6S1043基因座外，其余5个基因座发现的稀有等位基因均已在STRBase网站[18]公布的相关STR基因座的“off-ladder”中有报道。D6S1043基因座的三种稀有等位基因均在国内文献[19-22]中有报道，其中湖南汉族[19]和广东汉族[20]均发现这三种稀有等位基因，在浙江汉族[21]和云南汉族[22]中，除等位基因17.3外，其余两种稀有等位基因也均有发现。若要发现更多的稀有等位基因，无疑需要增加群体数量。此外，本研究发现在“off-ladder”等位基因中，Penta E的等位基因26，D2S441的等位基因9.3、10.3、12.3及13.3，FGA的等位基因21.2、22.2、23.2及24.2，D7S820的等位基因9.1，D6S1043的等位基因18，D1S1656的等位基因18，按照1/1000的标准[23]，以上“off-ladder”等位基因均不属于稀有等位基因。综上，华夏TM白金PCR扩增试剂盒在Ladder设计上可以进一步完善。

在本研究所比较的8种商业化STR检测试剂盒中，华夏TM白金PCR扩增试剂盒含有的基因座个数最多（25个），Sinofiler和Identifier试剂盒所含个数最少（16个）。本研究通过参数CPE和CDP比较8种商业化STR检测试剂盒的系统效能，其中，Identifier试剂盒的CPE和CDP值最低，华夏TM白金PCR扩增试剂盒的CPE和CDP值最高。这一数据与试剂盒中所包含的STR基因座及基因座个数相关。

结果表明，华夏TM白金PCR扩增试剂盒中的23个常染色体STR基因座在中国汉族人群中具有高度遗传多态性，与上述7种常用的商业化STR检测试剂盒相比，具有更高的亲权鉴定能力和个体识别能力。

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Forensic App lication of HuaxiaTMPlatinum Kit

WANG Ya-li1,2,SHENG Xiang2,3,LIMin2,4,CHEN Yu-ling2,5,LIN Yuan2,CHEN Li-qin1
（1.Department of Forensic Medicine,Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010030,China;2.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Institute of Forensic Science, Ministry of Justice,PRC,Shanghai 200063,China;3.Department of Forensic Medicine,Medical College of Soochow University,Suzhou 215123,China;4.School of Basic Medical Sciences,Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China;5.State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,School of Biotechnology, East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China）

ObjectiveTo investigate the genetic polymorphism of 23 autosomal STR loci of HuaxiaTMPlatinum kit in Chinese Han population,and to evaluate the forensic efficiency of HuaxiaTMPlatinum kit.MethodsA total of 500 unrelated healthy individuals from Han population were genotyped w ith HuaxiaTMPlatinum kit.The frequency distribution and the parameter of population genetics of STR loci were analysed statistically.HuaxiaTMPlatinum kit was compared w ith other 7 commercial STR kits commonly seen at home and abroad in the number of STR loci,interior label,fluorescent mark,total number of alleles in Ladder and system effectiveness.ResultsAll the 23 autosomal STR loci were consistent w ith Hardy-Weinberg equilibrium（P＞0.05）.The discrim ination power was 0.791 5-0.9862.The polymorphism information content（PIC）was 0.559 0-0.914 0.The combined discrimination power（CDP）was 1-4.1×10-28, while combined probability of paternity exclusion in trio（CPET）and in duo（CPED）were 1-4.1×10-10and 1-8.4×10-7,respectively.Compared w ith other 7 kits,HuaxiaTMPlatinum kit contained the most number of alleles w ithin the Ladder.ConclusionAll the 23 autosomal STR loci of HuaxiaTMPlatinum kit w ith highly polymorphic in Han population can be used for paternity testing and individual identification. Compared w ith other 7 kits,it appears that HuaxiaTMPlatinum kit can provide more genetic inform ation.

forensic genetics;short tandem repeat;polymorphism,genetic;HuaxiaTMPlatinum kit;Han nationality

DF795.2

：A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.02.005

1004-5619（2017）02-0129-07

2016-09-27）

（本文编辑：张素华）

十三五国家重点研发计划项目（2016YFC0800703）；上海市科委标准研制项目（16DZ0501600）；上海市法医学重点实验室资助项目（17DZ2273200）；上海市司法鉴定专业技术服务平台资助项目（16DZ2290900）

王亚丽（1990—），女，硕士研究生，主要从事法医遗传学研究；E-mail：1014762036@qq.com

陈丽琴，女，教授，硕士研究生导师，主要从事法医遗传学和法医病理学研究；E-mail：lqchenyj@163.com

通信作者：林源，男，主任法医师，主要从事法医遗传学研究；E-mail：liny@ssfjd.cn