窖蛋白基因变异及多态性与不明原因猝死的相关性

午方宇，唐新华，盖连磊，孔小平，郝博，黄二文，石河，盛立会，权力，刘水平，罗斌

（1.中山大学中山医学院法医学系，广东广州 510080；2.东源县公安局，广东东源 517500；3.广州市公安局黄埔区分局，广东广州 510530；4.广州市公安局番禺区分局，广东广州 511430；5.广州市公安局刑事科学技术研究所，广东广州 510030；6.深圳市公安局刑事科学技术研究所，广东深圳 518008）

·论著·

窖蛋白基因变异及多态性与不明原因猝死的相关性

午方宇1，唐新华2，盖连磊3，孔小平4，郝博1，黄二文1，石河5，盛立会6，权力1，刘水平1，罗斌1

（1.中山大学中山医学院法医学系，广东广州 510080；2.东源县公安局，广东东源 517500；3.广州市公安局黄埔区分局，广东广州 510530；4.广州市公安局番禺区分局，广东广州 511430；5.广州市公安局刑事科学技术研究所，广东广州 510030；6.深圳市公安局刑事科学技术研究所，广东深圳 518008）

目的寻求窖蛋白（caveolin，CAV）基因变异位点，探讨其与不明原因猝死（sudden unexplained death，SUD）的相关性。方法收集SUD组（71例）、冠状动脉疾病（coronary artery disease，CAD）组（62例）和对照组（60例）血样，分别提取基因组DNA，采用PCR方法扩增CAV1与CAV3基因编码区及外显子-内含子拼接区，进行直接测序，以明确CAV基因的遗传变异类型，并进行统计学分析。结果在SUD组中共检测到4个可能有意义的变异位点，其中2个为新发现的突变位点，分别为CAV1：c.45C＞T（T15T）和CAV1：c.512G＞A（R171H）；2个为SNP位点，分别为CAV1：c.246C＞T（rs35242077）和CAV3：c.99C＞T（rs1008642），且这两个SNP位点的基因型频率和等位基因频率在SUD组与对照组中差异具有统计学意义（P＜0.05），在CAD组中均未发现上述变异位点。结论部分SUD可能与CAV1和CAV3基因变异存在一定相关性。

法医病理学；法医遗传学；猝死，心脏；不明原因猝死；窖蛋白；基因突变；单核苷酸多态性

心源性猝死（sudden cardiac death，SCD）是指因心脏受到各种因素作用导致的、出现在1h之内的非暴力死亡，其发生往往难以预料[1]。SCD患者主要分为两大类，第一类为解剖阳性，占SCD的绝大多数，该类SCD死者经过法医学尸体解剖通常可检见冠状动脉疾病（coronary artery disease，CAD）[2，3]；第二类为解剖阴性，归类为不明原因猝死（sudden unexplained death，SUD），该类患者经全面的尸体解剖以及组织病理学检验、毒物检验等均未能发现明确死因[4]。当前，有研究[5-8]表明，离子通道病如长QT综合征（long QT syndrome，LQTS）、Brugada综合征、儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速（catecholaminergic polymorphicventricular tachycardia，CPVT）等引起的恶性心律失常可能成为导致SUD的主要原因之一。目前已发现50多种基因突变与离子通道病有关[9-11]，包括SCN5A、KCNQ1、NOS1AP等。窖蛋白（caveolin，CAV）作为胞膜窖的结构蛋白，其脚手架结构域可与多种心肌离子通道相结合并调控其功能，包括SCN5A编码的电压门控钠通道（Nav1.5）、KCNH2编码的电压依赖性钾通道（Kv11.1）[12，13]等。部分研究[14-16]发现，CAV基因发生突变可导致心肌钠通道及钾通道功能紊乱，影响心肌动作电位的产生，从而诱发恶性心律失常甚至猝死。

本研究选取SUD病例及CAD猝死病例为研究对象，筛查CAV基因编码区及外显子-内含子拼接区的突变位点，以期发现SUD与CAV基因的相关性，为该类猝死案件分子学死亡机制的研究提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集中山大学中山医学院法医病理学教研室2009—2016年受理的71例SUD者的心血样本作为SUD组，其中男性53例，女性18例，平均年龄（34.2± 8.4）岁。入选标准[17]：（1）平素体健，生前无重大疾病史；（2）死亡迅速（大多数从发病到死亡在1h之内）；（3）死亡时处于一般日常活动或睡眠状态；（4）死后经系统法医学尸体解剖及组织病理学检验未发现明确死因；（5）毒物检验未检出常见毒（药）物成分。由于部分血样中DNA降解，故部分多态性位点的实验组例数可能存在与样本总数不一致的情况。

收集中山大学中山医学院法医病理学教研室2009—2016年受理的62例CAD猝死者心血样本作为CAD组，其中男性40例，女性22例，平均年龄（41.3±9.4）岁。入选标准[18]：（1）死亡迅速（大多数从发病到死亡在1h之内）；（2）左、右冠状动脉分支狭窄在75%以上；（3）未发现其他致死性损伤、疾病及中毒。

收集中山大学中山医学院法医病理学教研室2009—2016年受理的60例死因明确且排除心源性疾病致死的案例，采其心血样本作为对照组，其中男性48例，女性12例，平均年龄（38.6±12.6）岁。该组死因主要为机械性损伤、机械性窒息、非心脏性致死性疾病和中毒。

1.2 DNA提取、目的片段PCR扩增及产物测序

使用血样基因组DNA磁珠法提取试剂盒（长春市博坤生物科技有限公司）于DNA自动化提取工作站（烟台澳斯邦生物工程有限公司）从SUD组、CAD组及对照组心血白细胞中提取DNA。

根据GeneBank已知人类CAV1及CAV3的基因序列（NG_012051、NG_008797），使用Primer Premier 5.0软件设计引物（表1～2），由北京六合华大基因科技股份有限公司合成引物。

表1 CAV1基因PCR扩增区域及相应引物

表2 CAV3基因PCR扩增区域及相应引物

应用PCR扩增方法对CAV1和CAV3基因编码区以及外显子-内含子拼接区进行扩增。PCR反应体系：GoTaq®Green反应混合物（包括2×Green GoTaq®反应缓冲液、400μmol/L dATP、400μmol/L dGTP、400μmol/L dCTP、400μmol/L dTTP和3mmol/L MgCl2，美国Promega公司）12.5μL，ddH2O 7.5μL，模板DNA溶液3μL（0.5 ng/μL）以及正向及反向引物各1μL（10μmol/L），共25μL。反应条件：95℃预变性2min；95℃变性30 s，退火温度（表1～2）40 s，72℃延伸55 s，共35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

PCR扩增产物的纯化与直接测序均由北京六合华大基因科技股份有限公司完成，测序引物与PCR引物相同（表1～2）。

1.3 结果分析

使用DNAStar、SeqMan等分析软件将测序结果与美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）基因数据库中相应基因cDNA序列进行比对分析。

发现的可疑突变位点均重新提取相关血样DNA进行双向测序验证。如遇错义突变，分析其编码氨基酸的改变，并使用PolyPhen-2软件预测其致病性。

对于发现的可疑单核苷酸多态性（SNP）位点，计算并比较各SNP位点在SUD组、CAD组及对照组中的基因型频率及等位基因频率，并进行Hardy-Weinberg平衡检验，检验水准α=0.05。基因型频率=基因型个体数/该二倍体群体总数，等位基因频率=（基因纯合子个体数×2+基因杂合子个体数）/（群体总数×2）。

2 结果

2.1 CAV1与CAV3基因的突变检测

对71例SUD组血样的PCR产物进行直接测序，测序结果与CAV1及CAV3基因cDNA序列进行比对，共发现4个突变位点（表3），均位于CAV1基因，其中2个位点位于内含子区（c.30+28C＞T；c.31-42C＞T），另外2个位点位于外显子编码区（c.45C＞T；c.512G＞A），其中c.45C＞T为同义突变，c.512G＞A为错义突变。经与NCBI基因数据库中收录基因突变比对后，证实上述位于外显子编码区的2个突变位点为新发现的突变位点。

表3 本研究发现的SUD组CAV1基因突变位点

CAV1基因内含子区的突变位点对窖蛋白结构与功能的影响可能性较小，故不予讨论。CAV1基因外显子编码区第一个突变位点45C＞T在第31号病例中发现，发生在CAV1基因第二个外显子，其基因型由CC变为CT，但对应的第15位氨基酸苏氨酸并未发生改变，属同义突变，即T15T（图1A）；第二个突变位点512G＞A在第23号病例中发现，发生在CAV1基因第三个外显子，其基因型由GG变为GA，导致其编码的第171位氨基酸由精氨酸转变为组氨酸，属错义突变，即R171H（图1B），使用PolyPhen-2等软件预测该错义突变导致氨基酸改变的致病性，证实该突变致病概率可能较高。在CAD组及对照组中均未发现上述突变。

图1 CAV1基因中新发现突变在SUD组、CAD组及对照组的测序图

2.2 CAV1与CAV3基因的多态位点检测

对71例SUD组血样的PCR产物进行直接测序，共发现8个SNP位点：CAV1：c.246C＞T（rs35242077）；CAV1：c.*328A＞G（rs34123906）；CAV1：c.*1186G＞A（rs577466219）；CAV3：c.-33G＞T（rs72546666）；CAV3： c.99C＞T（rs1008642）；CAV3：c.*645A＞T（rs11476）；CAV3：c.*783A＞G（rs7629329）；CAV3：c.*811C＞G（rs10882）。上述8个SNP位点的等位基因频率和基因型频率在两组人群的多态性分布详见表4～11。其中CAV1：c.246C＞T（rs35242077）和CAV3：c.99C＞T（rs1008642）位点的等位基因频率和基因型频率在SUD组和对照组中的分布差异具有统计学意义（P< 0.05）。CAV1：c.246C＞T（rs35242077）和CAV3：c.99C＞T（rs1008642）这两个SNP位点分别位于CAV1、CAV3基因的外显子编码区，其碱基的改变对氨基酸的表达均未造成影响，属于同义多态。

对CAD组血样的PCR产物进行直接测序，结果显示，上述8个SNP位点的基因型频率和等位基因频率在CAD组与对照组中的分布差异无统计学意义（P>0.05），但上述SNP位点在SUD组和CAD组中基因型频率及等位基因频率的分布差异存在统计学意义（P＜0.05）。

表4 CAV1基因中c.246C＞T位点（rs35242077）的基因型频率及等位基因频率[n（%）]

表5 CAV1基因中c.*328A＞G位点（rs34123906）的基因型频率及等位基因频率[n（%）]

表6 CAV1基因中c.*1186G＞A位点（rs577466219）的基因型频率及等位基因频率[n（%）]

表7 CAV3基因中c.-33G＞T位点（rs72546666）的基因型频率及等位基因频率[n（%）]

表8 CAV3基因中c.99C＞T位点（rs1008642）的基因型频率及等位基因频率[n（%）]

表9 CAV3基因中c.*645A＞T位点（rs11476）的基因型频率及等位基因频率[n（%）]

表10 CAV3基因中c.*783A＞G位点（rs7629329）的基因型频率及等位基因频率[n（%）]

表11 CAV3基因中c.*811C＞G位点（rs10882）的基因型频率及等位基因频率[n（%）]

3 讨论

Vatta等[14]发现CAV3基因突变与Nav1.5共表达时，晚钠电流即会增强，增强的晚钠电流在动作电位时程中延长心肌复极化从而导致QT间期延长。故CAV基因可能为影响心脏电生理的重要基因，通过介导离子通道的功能而影响心肌细胞动作电位的改变，导致心室延迟复极、QT间期延长甚至致死性心律失常。

本研究对CAV1和CAV3基因在71例SUD组及60例对照组中进行序列对比筛查，在SUD组共发现2个位于外显子编码区的突变（T15T、R171H），经与NCBI基因数据库中收录基因突变比对后，证实上述位于外显子编码区的2个突变位点为新发现的突变位点。T15T位于CAV1基因第二个外显子，当第45位等位基因C突变为T后，其编码的第15位苏氨酸未发生改变，属同义突变。普遍认为基因突变导致氨基酸序列改变可能会造成蛋白质功能异常，而突变的核苷酸序列若无相应氨基酸改变则认为是无害的，不会影响蛋白质的功能。但部分研究[19-21]表明，同义突变可能会影响转录时剪接的准确性、翻译的保真度以及蛋白质的构象和功能。故该同义突变亦可能对其编码蛋白质功能造成影响。R171H位于CAV1基因第三个外显子，当第512位等位基因G突变为A后，其编码的第171位氨基酸由精氨酸变为组氨酸，属错义突变。经PolyPhen-2等蛋白质预测软件预测该突变的致病性，证实该突变致病概率可能较高。CAV1第171位氨基酸位于其羧基端，并不在其脚手架区域，但该区域可能在调控脚手架区域与离子通道结合中起作用，其致病机制仍需下一步进行功能研究予以证实。

除了上述突变位点外，本研究还在SUD组发现8个SNP位点，其中2个SNP位点的等位基因频率和基因型频率在SUD组与对照组中的分布差异存在统计学意义（P<0.05），分别位于CAV1（rs35242077）与CAV3（rs1008642）基因，提示rs35242077与rs1008642可能是SUD易感基因位点。第一个SNP位点rs35242077位于CAV1基因编码的脚手架结构域内，该区域包含与离子通道蛋白相结合的特异性位点，位于脚手架区域的部分位点发生变异，可能会影响与通道蛋白结合强度，进而导致离子通道功能的改变甚至心律失常的发生，据此推测rs35242077可能是SUD易感基因位点。第二个SNP位点rs1008642位于CAV3基因的第一个外显子，在对照组T等位基因频率，即最小等位基因频率（mirror allele frequency，MAF）为0.450，而在SUD组MAF值则下降到0.261；对照组中，CC的基因型频率为0.267，而在SUD组中，CC的基因型频率则为0.577。该SNP位点等位基因频率和基因型频率在SUD组和对照组中差异均具有统计学意义（P<0.05）。提示rs1008642位点可能为SUD易感基因位点，该位点的多态性分布可能与SUD存在一定的相关性。

Asker等[22]研究发现，CAV1基因多态性T29107A、G14713A与阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）有关，亦有文献[23，24]证实部分OSAS患者心电图呈现长QT表现，OSAS可能为SCD的一个重要因素。由于T29107A及G14713A均位于CAV1基因的内含子区，本研究就CAV1基因外显子编码区及拼接区进行基因筛查，未对上述两个内含子区位点进行检测，下一步研究将对CAV1基因内含子区易感基因位点进行筛查。现有文献报道[25]，CAV3基因部分突变位点如V82I、F97C、S141R可能与长QT综合征9型（LQT9）有关，但本研究对71例SUD者进行CAV3基因检测并未发现上述突变的发生，考虑可能为本研究样本量较小所致，不排除扩大样本量后将会出现相应突变的改变。

本研究亦对62例CAD组CAV1和CAV3基因外显子及拼接区进行测序，并未检出可疑突变位点，且也未发现与对照组基因型或等位基因存在明显差异的SNP位点。但SUD组中发现的部分SNP位点与CAD组对比，其基因型及等位基因频率存在明显差异。据此初步认为SUD分子病因可能与CAD不同，目前大多数CAD者直接死因为急性缺血缺氧导致心功能障碍死亡，SUD者死因则更倾向于恶性心律失常所致。除CAD外，部分心肌病（如致心律失常性右室心肌病）、传导系统疾病（如病态窦房结综合征）等也可能与某些离子通道基因或相关基因有关。本课题组下一步工作将对该类人群CAV1和CAV3基因进行检测，以明确CAV1和CAV3基因变异与其他心源性疾病是否存在关联性，即不同SCD者CAV1和CAV3基因的多态性分布是否存在差异。

本研究对中国人群SUD病例的CAV基因突变位点进行筛查，初步发现2个变异位点（CAV1：c.45C＞T和CAV1：c.512G＞A），而上述位点在对照组中未出现，考虑CAV基因突变可能与SUD的发生相关，上述位点有可能导致SUD的发生，但并不能排除为假阳性的表现。另外本研究在CAV1及CAV3基因中发现2个多态性位点（rs35242077、rs1008642），其在SUD组与对照组间的分布差异存在统计学意义，考虑可能为SUD易感基因位点，但其是否致病及相关致病机制仍需在后续研究中予以确认。

[1]Hua W，Zhang LF，Wu YF，et al.Incidence of sudden cardiac death in China：analysis of 4 regional populations[J].JAm Coll Cardiol，2009，54（12）：1110-1118.

[2]Myerburg RJ，Junttila MJ.Sudden cardiac death caused by coronary heart disease[J].Circulation，2012，125（8）：1043-1052.

[3]Tomaselli GF，Barth AS.Ion Channel Diseases：an Update for 2016[J].Curr Treat Options Cardiovasc Med，2016，18（3）：21.

[4]官大威，赵锐.离子通道病所致的心源性猝死与死后基因检测技术[J].法医学杂志，2010，26（2）：120-127.

[5]Kauferstein S，Kiehne N，Jenewein T，et al.Genetic analysis of sudden unexplained death：a multidisciplinary approach[J].Forensic Sci Int，2013，229（1-3）：122-127.

[6]Brion M，Quintela I，Sobrino B，et al.New technologies in the genetic approach to sudden cardiac death in the young[J].Forensic Sci Int，2010，203（1-3）：15-24.

[7]Kauferstein S，Kiehne N，Neumann T，et al.Cardiac gene defects can cause sudden cardiac death in young people[J].Dtsch Arztebl Int，2009，106（4）：41-47.

[8]Elger BS，M ichaud K，Fellmann F，et al.Sudden death：ethical and legal problems of post-mortem forensic genetic testing for hereditary cardiac diseases[J].Clin Genet，2010，77（3）：287-292.

[9]George AL Jr.Molecular and genetic basis of sudden cardiac death[J].J Clin Invest，2013，123（1）：75-83.

[10]黄京璐，郝博，王小广，等.中国汉族人群不明原因猝死与NOS1AP基因多态性的相关性[J].法医学杂志，2014，30（1）：27-30，35.

[11]王纯，王辉，许心舒，等.外显子组测序对1例青壮年猝死的分子遗传学分析[J].法医学杂志，2015，31（6)：436-440.

[12]Yarbrough TL，Lu T，Lee HC，et al.Localization of cardiac sodium channels in caveolin-rich membrane domains：regulation of sodium current amplitude[J].Circ Res，2002，90（4）：443-449.

[13]Ma Q，Yu H，Lin J，et al.Screening for cardiac HERG potassium channel interacting proteins using the yeast two-hybrid technique[J].Cell Biol Int，2014，38（2）：239-245.

[14]Vatta M，Ackerman MJ，Ye B，et al.Mutant caveolin-3 induces persistent late sodium current and is associated w ith long-QT syndrome[J].Circulation，2006，114（20）：2104-2112.

[15]Guo J，Li X，Shallow H，et al.Involvement of caveolin in probucol-induced reduction in hERG plasma-membrane expression[J].Mol Pharmacol，2011，79（5）：806-813.

[16]Vaidyanathan R，Vega AL，Song C，et al.The interaction of caveolin 3 protein w ith the potassium inward rectifier channel Kir2.1：physiology and pathology related to long qt syndrome 9（LQT9）[J]. J Biol Chem，2013，288（24）：17472-17480.

[17]Liu C，Tester DJ，Hou Y，et al.Is sudden unexplained nocturnal death syndrome in Southern China a cardiac sodium channel dysfunction disorder?[J]. Forensic Sci Int，2014，236：38-45.

[18]Steinberg C，Laksman ZW，Krahn AD.Sudden cardiac death：A reappraisal[J].Trends Cardiovasc Med，2016，26（8）：709-719.

[19]Sauna ZE，Kimchi-Sarfaty C.Understanding the contribution of synonymousmutations to human disease[J]. Nat Rev Genet，2011，12（10）：683-691.

[20]Hunt RC，Simhadri VL，Iandoli M，et al.Exposing synonymous mutations[J].Trends Genet，2014，30（7）：308-321.

[21]Czech A，Fedyunin I，Zhang G，et al.Silentmutations in sight：co-variations in tRNA abundance as a key to unravel consequences of silent mutations[J].Mol Biosyst，2010，6（10）：1767-1772.

[22]Asker S，Taspinar M，Koyun H，et al.Caveolin-1 polymorphisms in patients w ith severe obstructive sleep apnea[J].Biomarkers，2017，22（1）：77-80.

[23]Shamsuzzaman AS，Somers VK，Knilans TK，et al. Obstructive Sleep Apnea in Patients w ith Congenital Long QT Syndrome：Implications for Increased Risk of Sudden Cardiac Death[J].Sleep，2015，38（7）：1113-1119.

[24]Gam i AS，Olson EJ，Shen WK，et al.Obstructive sleep apnea and the risk of sudden cardiac death：a longitudinal study of 10，701 adults[J].J Am Coll Cardiol，2013，62（7）：610-616.

[25]Lariccia V，Nasti AA，A lessandrini F，et al.Identification and functional analysis of a new putative caveolin-3 variant found in a patient w ith sudden unexplained death[J].J Biomed Sci，2014，21：58.

Correlation between Genetic Variants and Polym orphism of Caveolin and Sudden Unexplained Death

WU Fang-yu1,TANG Xin-hua2,GAI Lian-lei3,KONG Xiao-ping4,HAO Bo1,HUANG Er-wen1,SHI He5, SHENG Li-hui6,QUAN Li1,LIU Shui-ping1,LUO Bin1
（1.Department of Forensic Medicine,Zhongshan Medical College,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China;2.Dongyuan Public Security Bureau,Dongyuan 517500,China;3.Huangpu Branch of Guangzhou Municipal Public Security Bureau,Guangzhou 510530,China;4.Panyu Branch of Guangzhou Municipal Public Security Bureau,Guangzhou 511430,China;5.Institute of Criminal Science and Technology,Guangzhou Municipal Public Security Bureau,Guangzhou 510030,China;6.Institute of Criminal Science and Technology,Shenzhen Municipal Public Security Bureau,Shenzhen 518008,China）

ObjectiveTo explore the genetic variation sites of caveolin（CAV）and their correlation w ith sudden unexp lained death（SUD）.MethodsThe blood samples were collected from SUD group（71 cases）, coronary artery disease（CAD）group（62 cases）and control group（60 cases）,respectively.The genome DNA were extracted and sequencing was performed directly by amplifying gene coding region and exonintron splicing region of CAV1 and CAV3 using PCR.The type of heritable variation of CVA was confirmed and statistical analysis was performed.ResultsA total of 4 variation sites that maybe significative were identified in SUD group,and two were new found which were CAV1：c.45C＞T（T15T）and CAV1：c.512G＞A（R171H）,and two were SNP loci which were CAV1：c.246C＞T（rs35242077）and CAV3：c.99C＞T（rs1008642）and had significant difference（P＜0.05）in allele and genotype frequencies between SUD and control groups.Forementioned variation sites were not found in CAD group.ConclusionThe variants of CAV1 and CAV3 may be correlated w ith a part of SUD group.

forensic pathology;forensic genetics;death,sudden,cardiac;sudden unexplained death;caveolin;gene mutation;single nucleotide polymorphism

DF795.1

：A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.02.002

1004-5619（2017）02-0114-06

2016-12-05）

（本文编辑：黄平）

国家自然科学基金资助项目（81430046，81671866）；十二五国家重大科技攻关项目（2012BAK02B002）；广东省自然科学基金自由申请项目（2016A030313223）；上海市法医学重点实验室开放课题资助项目（2013KF1307）

午方宇（1992—），男，硕士研究生，主要从事心源性猝死的病理学研究；E-mail：719139789@qq.com

罗斌，男，主任法医师，硕士研究生导师，主要从事心源性猝死、过敏性休克的病理学研究；E-mail：luobin@mail. sysu.edu.cn