云南猪群中猪捷申病毒感染分子生物学诊断

2017-05-12赵国洪韩建强邹丰才信爱国

养猪 2017年2期

赵国洪，严欢，韩建强，赵津，邹丰才，信爱国

（1．云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224；2.玉溪农业职业技术学院，云南玉溪 653106；3.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201）

云南猪群中猪捷申病毒感染分子生物学诊断

赵国洪1，2，严欢1，3，韩建强2，赵津2，邹丰才3，信爱国1

猪捷申病是由猪捷申病毒（Porcine teschovirus，PTV）感染引起的猪的一种病毒性传染病。文章根据GenBank收录的PTV基因序列设计套式引物，建立检测PTV的套式RT-PCR诊断方法；从云南省某猪场疑似猪捷申病的病料中检测出PTV核酸阳性，产物经克隆测序，与GenBank收录的PTV毒株序列比对，结果表明该扩增序列与PTV同源性为99%～95%，首次在云南确诊了PTV感染存在。

猪捷申病毒（PTV）；RT-PCR；分子诊断

猪捷申病毒（Porcine teschovirus,PTV）可引起猪传染性脑脊髓灰质炎、下痢、心肌炎、心包炎、肺炎、繁殖障碍和皮肤损伤或者无临床症状等多种临床表现的猪捷申病。该病的发病率可达50%，致死率达70%～90%，给养猪业带来了巨大的经济损失[1]。PTV原归属于猪肠道病毒（Porcine enterovirus,PEV）Ⅰ类群，在分子结构及系统进化中与PEV其他2类群血清型毒株相异，有着独特的特征，因此，目前已将猪肠道病毒的类群Ⅰ各血清型单独归为猪捷申病毒属。目前已报道的PTV有11种不同血清型[1]。目前捷申病毒已遍布亚洲，国内2003年首次从内蒙古地区某猪场分离得到第1株猪捷申病毒[2]，随后在我国大部分猪场均有PTV分离报道[3-7]，而且PTV常伴随着猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染[8]和与猪圆环病毒2型混合感染[9]，这说明PTV在我国猪场中呈现混合感染的趋势，给养猪业带来巨大损失。省内最早2003年在云南兰坪[10]和2007年在云南马龙[11]有对疑似该病的临床诊治报告，但都没有实验室确诊报告。自2013年以来，云南多地猪场出现仔猪死亡、腹泻，以肠炎、脑脊髓灰质炎、心肌炎、心包炎、肺炎为主，伴随繁殖障碍为主要临床症状疫病。经临床症状和实验室诊断，排除了猪的主要几种疫病病原，最后采用分子诊断技术确诊为PTV感染所致。

1 材料与方法

1.1 检测样品处理

样品采自2013年9月，云南某地规模化养猪场，发病猪群主要为断奶仔猪，取样时该猪场猪群中有猪只出现神经症状，主要表现为后肢麻痹，呈犬坐姿势，呼吸困难，并伴有腹泻；猪只对刺激敏感，稍微刺激就尖叫。对发病猪进行放血，采集脑、心脏、肝脏、淋巴结、肺脏、脾脏、小肠等组织进行送检。对采集到的病猪组织样品进行研磨处理，按每克样品加3 mL灭菌PBS充分研磨，制备成组织悬液。把组织悬液置于-80℃冻存20 min后取出溶解，重复3次。置于4℃条件下3 000 r/min离心20 min，取上清液置于低温保存备用。

1.2 主要试剂

病毒总RNA提取试剂（RNAiso Plus）购自宝生物（大连）有限公司；cDNA合成试剂盒（TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super－Mix）、pEasy T1 Cloning Kit和 2×EasyPfu PCR SuperMix试剂购自北京全式金生物技术有限公司；PCR胶回收试剂盒和DNA Marker DL 2 000购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 PTV引物的设计与合成

参照GenBank收录的PTV基因5′-非编码区（5′-UTR）保守序列，经过比对分析，采用Primer Premier 5.0引物设计软件分析，设计2对引物，建立检测PTV所有血清型的套式RT-PCR方法。引物序列见表1。引物由昆明硕擎生物有限公司合成。

表1 PTV套式RT-PCR引物

1.4 组织中核酸提取

按RNAiso Plus提取试剂的说明书，提取病猪组织中总RNA。

1.5 PTV套式RT-PCR检测

1.5.1 病毒cDNA的制备按TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书进行cDNA的制备。反应体系（体系20 μL）组分如下：RNA 7.5 μL，PTV-1R 0.5 μL，2×TS Reaction Mix 10 μL，gDNA Removal 1.0 μL，Tran－Script RT/RI Enzye mix 1.0 μL。轻轻混匀，42℃30 min，85℃5 s，4℃保存备用。

1.5.2 套式PCR反应第一轮PCR扩增：PCR反应总体积为25 μL，cDNA 1 μL，PTV-1F/PTV-1R（10 μM）各0.5 μL，2×EasyPfu PCR SuperMix 12.5 μL，补水至25 μL。反应条件：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，共扩增35个循环；最后72℃延伸7 min。

第二轮PCR扩增：首轮PCR反应结束后，取该轮PCR产物1 μL作为模板，使用PTV-1nF和PTV-1nR各0.5 μL作为引物，其余反应体系及条件与首轮相同。反应结束后，用1.5%琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳鉴定。

1.5.3 扩增产物的分子克隆及序列比对分析第二轮PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，使用胶回收试剂盒回收目的条带，将其连接于pEasy T1载体中，转化DH5α，挑选阳性克隆送昆明硕擎生物有限公司测序。所测序列采用VectorNTI 8.0软件包中Contig Express整理拼接，之后提交GenBank进行Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对分析。

1.6 其他几种猪病的实验室诊断

对病料进行猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪kuba病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪轮状病毒（Rotavirus）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）检测，按照云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室对上述猪病检测方法进行。

2 结果

2.1 发病临床症状观察及病理变化

据观察统计，感染猪场中断奶仔猪中发病率53.5%（45/84）。患病猪体温升高，食欲废绝，被毛粗乱，呼吸困难，呕吐、腹泻及行动失调。1～2 d后，体温降至正常后出现神经症状，呈现四肢麻痹僵直（特别是后肢）和昏迷，病猪呈犬坐姿势或于一侧卧地，前肢作划水样，受声响或触摸刺激时，可引起四肢不协调的运动，或角弓反张，也可见面部麻痹和失音。部分病猪伴有腹泻。

病理剖检可见胸膜粘连，心脏表面附着灰白色纤维素性渗出物却不易剥落，心肌坏死和浆液性纤维素性心包炎病变（图1A和B）；肺部尖叶、心叶有灰色实变区（图1C）；腹股沟淋巴结、颌下淋巴结肿大；肠黏膜充血、出血，肠壁变薄；也有患病猪观察不到特征性的病变。

图1 PTV患病猪病理剖检

2.2 其他猪相关病原检测结果

送检病料对猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪kuba病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪轮状病毒（Rotavirus）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）进行了检测，均为阴性结果，排除了上述这几种病原的感染。

2.3 PTV套式RT-PCR检测结果

将疑似PTV的病料中各组织匀浆后提取病毒基因组RNA，经反转录得cDNA，以其为扩增模板，用PTV特异性检测引物进行鉴定。结果显示，样品获得与预期的158 bp条带一致的特异性扩增条带，初步判定送检的病料为PTV阳性（图2）。

图2 PTV临床样品检测结果

2.4 PTV病料PCR扩增产物测序分析结果

将上述第2轮PCR扩增产物纯化连接于pEasy T1载体中，挑阳性克隆测序，采用VectorNTI 8.0软件读取数据，分析处理后，得到下列序列（图3）。经提交GenBank进行Blast比对分析后发现，提交比对序列与GenBank收录的猪PTV序列同源性在99%～95%之间，其中与中国分离株（swine/CH/IMH/ 03）的同源性为98%，从病毒的进化分类结果显示该核酸序列来源于PTV基因组（图4）。结果表明送检猪病料为PTV感染，将送检病料命名为PTV/YN/ 2013。

图3 PTV/YN/2013病原核酸检测序列克隆测序结果

图4 PTV/YN/2013核酸序列Blast比对结果

3 讨论

猪捷申病在我国是一种新出现的猪只疫病，目前主要采用病毒分离鉴定和分子生物学检测进行诊断。在云南地区，虽然有两例疑似病例报道[10-11]，都没有进行确诊。本文采用RT-PCR扩增PTV特异基因，结合核酸序列比对分析方法，首次对云南省猪群中对PTV感染引发的猪捷申病做出确诊。证实云南省存在PTV感染，为我省的养猪疫病防控提供了科学依据。此外，PTV常和PRRSV、PCV2或其他一些容易引起猪产生神经症状和以流产为主要症候群的疫病引起相似临床症状，我们对这些猪常见疫病进行了鉴别诊断，排除了几种病原感染的可能性，明确了该次疫病是由PTV感染所致。但是据报道，PTV目前在我国主要和PRRSV、PCV2混合感染，主要引起流产、仔猪死亡以及腹泻、肠炎等[12]。因此，对PTV进行快速、准确的诊断对该病的控制具有重要意义。

猪是捷申病毒的唯一宿主，不同年龄的猪都易感，仔猪的易感性较强。PTV血清型众多，相互之间没有交叉免疫性，在同一猪群中可有多个血清型，任何年龄的猪在感染某一血清型毒株后，可再感染其他血清型毒株。本次所检测到的猪PTV具体属于猪捷申病毒属的哪个血清型还需进一步对病毒进行分离鉴定。此外，引起神经症状、母猪繁殖障碍、肠炎、肺炎、心包炎和心肌炎等症状的疾病很多，PTV在云南地区流行的情况还不清楚，有必要进一步对PTV开展病原学及血清学调查。

应对PTV的防控策略，目前国内外对猪捷申病尚无有效的治疗方法，也无特效抗病毒药物，只有采取综合防制措施，才会有效降低发病率和死亡率。因此，建议猪场坚持自繁自养，尽量减少外购猪的数量，严格控制外购猪的质量。加强饲养管理，特别要注意提高饲粮中能量饲料的供给，完善防寒保暖措施，提高猪群整体抗病能力。搞好猪舍的清洁卫生和消毒工作。猪场一旦感染发病，除用抗菌药物防止细菌继发感染外，还要采取隔离措施，防止发病猪舍的病毒传到健康舍。因该病毒在环境中广泛存在，建议用发病猪的病料组织（如心、肝、脾、肺、肾或脑组织）分离病毒，如能从病料组织中分离到病毒，说明猪场确实存在此病，可用从病料组织中分离出的病毒研制疫苗；如果仅在肠道里分离到病毒，有可能是带毒[13]。也有建议采用后备种猪与隐性感染猪混养或接近混养，促使健康猪群产生抗体而达到预防的目的。但是，猪捷申病在我国尚未形成暴发流行，因此，搞好环境卫生、做好保健工作，加强饲养管理才是最重要防控措施。

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（编辑：郭玉翠）

S858.285.3

1002-1957(2017)02-0113-03