F波评估兔不同程度永久性腰髓缺血损伤动物模型的价值

栾金利，杨传超，宋启民，程彦昊，费昶，张健

(1.潍坊医学院，山东潍坊261053；2.临沂市人民医院神经外科，山东临沂276000)

F波评估兔不同程度永久性腰髓缺血损伤动物模型的价值

栾金利1，杨传超1，宋启民2，程彦昊2，费昶2，张健2

(1.潍坊医学院，山东潍坊261053；2.临沂市人民医院神经外科，山东临沂276000)

目的探讨兔胫后神经F波对不同水平永久性腰髓缺血动物模型的评估作用。方法30只新西兰大白兔采用完全随机方式分为6组，1组为对照组，其余5组为实验组。对照组(n=5)用于确定最佳刺激强度，并用于排除麻醉和手术对F波的影响，实验组(n=5)分别结扎左肾动脉和动脉分叉间不同水平的腰动脉，腰动脉结扎后2 h和2 d记录F波，分别在麻醉清醒后和手术后2 d进行运动功能评分，分析实验各组术后2 h F波波幅变化与下肢运动功能的相关性，2 d后取缺血中心区标本进行HE染色，观察缺血区病理变化。结果F波的波幅在1根组和2根组结扎前后没有明显的变化(P＞0.05)，结扎前后不同时间点经方差分析，差异均无统计学意义(P＞0.05)，；结扎3根组、4根组和5根组血管后的F波的波幅下降，各组结扎前后不同时间点波幅经方差分析，差异均有统计学意义(P＜0.05)；F波的潜伏期在1根组和2根组结扎前后没有明显的变化(P＞0.05)，在3根组、4根组和5根组随着缺血程度的增加逐渐延长，各组潜伏期结扎前后不同时间点经方差分析，差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论兔下肢胫后神经F波的潜伏期不能量化反映腰髓缺血损伤程度，但严重缺血后潜伏期也可延长；F波波幅能够反映腰髓缺血损伤程度并且能够预测脊髓的功能。

F波；脊髓；缺血；腰动脉；兔

腰部脊髓损伤所引起的下肢瘫痪、大小便功能障碍及性功能障等是严重的伤残，严重影响了患者的生活质量。通过建立腰髓损伤动物模型加深对腰髓损伤后生理和功能反映的研究[1]，可以有效地帮助术者在脊髓肿瘤及脊柱病变手术中预防对腰部脊髓产生不可逆性损伤的发生[2]。腰部脊髓损伤动物模型的建立及评估方法多种多样，例如各种主观脊髓功能评分、电生理评估和脊髓的病理分子生物学评估等。部分研究资料表明F波的波幅及其变化可以有效的反映脊髓前角运动神经元细胞的功能状态[3]，F波潜伏期的长短可以有效地反映脊髓运动神经根的功能状态[4]。本实验中，我们在显微镜下依次仔细分离出新西兰大白兔左肾动脉和动脉分叉之间的不同水平的腰动脉，并连接好一次性针式刺激电极和记录电极。实验中从头侧到尾侧依次结扎腰升动脉，以便造成不同程度的腰髓缺血性损伤，并观察F波在不同水平的永久性腰髓缺血损伤动物模型的变化，以此来评估F波在不同程度永久性腰髓缺血损伤中的价值。

1 材料与方法

1.1 仪器及材料美国EOCHXP神经电生理监测设备(由临沂市人民医院神经外三科提供，美国的Axon syetem公司)；一次性针式刺激电极和记录电极；导线若干；动物实验手术器械一套；多聚甲醛；3%的戊巴比妥钠；磷酸盐缓冲液(PBS)等。

1.2 实验动物与分组取体质量在3.0～3.5 kg之间的、健康的新西兰大白兔30只，不限定雌雄，应用完全随机方式将大白兔随机的分为对照组(n=5)和实验组(n=5)。对照组是用来排除手术和麻醉对F波造成的影响。实验组沿头尾的方向、依次来结扎左侧肾动脉与动脉分叉之间的不同水平的腰动脉，分为1根组、2根组、3根组、4根组和5根组，共5组。对照组(n=5)的新西兰大白兔被麻醉后，此后每30 min时记录一组F波，连续记录3 h，用以排除麻醉药物对F波的影响；对照组(n=5)行手术操作时，分离出腰动脉但不结扎腰动脉，在手术前(和手术)后不同时间内分别记录下F波，用以排除手术对F波的影响。在实验组的5组内，沿头尾方向的顺序，依次结扎在左肾动脉和动脉分叉之间的不同水平的腰动脉，在腰动脉结扎后连续记录下F波，并且记录术后2 h和术后2 d的F波，于术后2 d后取腰髓行HE染色，并在镜下观察。

1.3 手术步骤动物实验室内，用紫光灯消毒30 min后，取3%戊巴比妥钠，通过兔耳缘静脉注射麻醉(l mL/kg)实验用兔，在实验过程中可根据动物的反应，追加初始剂量的1/3～1/2。动物腹部、下肢踝关节以及足底部常规备皮，酒精纱布擦洗消毒。将兔子的四肢牢固的固定在手术操作台上，在兔子腹部正中，做一长约10 cm的纵行切口，再沿中线逐层分离后，切开覆膜，将腹腔的肠道小心的翻向动物右侧，用浸泡过温生理盐水的湿纱布包裹肠管，以减少水分蒸发和热量散失来预防组织坏死。在腹膜后区仔细的、钝性分离出腹主动脉和下腔静脉，然后再依次分离出左肾动脉和动脉分叉处之间的5条腰动脉，如果遇到血管变异，则将该动物排除在实验之外。在实验过程中空调开放后，室内温度保持在24℃～26℃之间，维持肛温不低于38℃，并根据术中出血情况，通过静脉补充相应的生理盐水以维持血容量。在实验操作完毕之后依次逐层缝合腹膜层、肌肉层、皮肤。青霉素40万单位肌肉注射以预防感染。

1.4 兔胫后神经F波刺激的记录方法刺激电极的阴极为刺激端，固定于兔踝关节后部近心端，阳极为参考电极，固定在刺激电极的下方。记录电极的安放：记录电极的阴极在足底跖肌的肌腹表面，阳极在其下方的肌腱上，两者之间的距离大约为5 mm，刺激和记录电极之间接地。参数设置：刺激强度4～8 mA(引起足部轻轻抖动)；单脉冲自动刺激；刺激频率：1 Hz；刺激间期：0.3 ms。记录参数：显示灵敏度：500µv/div；时间基线：5 ms/div；带通滤波范围：50～3 000 Hz；平均化处理10个信号，信号分析时间：50 ms；陷波滤波器50 Hz关闭。

1.5 Tarlov下肢运动功能评分标准0级：后肢无运动不能负重；1级：后肢可见活动，但不能负重；2级：后肢活动频繁或有力，不能负重；3级：后肢可支持体重，可行走1～2步；4级：可行走仅有轻度障碍；5级：行走正常。

1.6 统计学方法应用SPSS17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差()表示，多组间计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，相关性采用Pearson相关性分析，均以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 动物模型成功情况本实验所采用的30只新西兰大白兔，其中2只兔子分别因为腰动脉的变异或术中大出血被排除外，余下的28只兔子均顺利的通过了手术以及术后的评估过程。兔子麻醉清醒后，可自由进食，动物模型的成功率为93.3%。

2.2 麻醉后F波的波形及其测量正常值在本次实验中，麻醉后共有28只兔子记录下理想的F波的波形，采用波形的各个组成成分的极性(P或N)，各成分出现的先后顺序对波形进行命名，以数字1、2…表示，如N1、N2…，P1、P2…。F波的波形为多相波(图1)，在手术结扎前，28只兔子的F波的潜伏期是(11.2±1.4)ms，波幅为(790.3±589.5)μV。

2.3 对照组对照组在麻醉后不同时间的F波的波幅和潜伏期经统计学分析，差异无统计学意义(P＞0.05)；对照组假手术前后的不同时间，波幅和潜伏期经统计学分析，差异无统计学意义(P＞0.05)，因此认为在实验过程中，F波的变化与麻醉和手术无关。

2.4 实验组F-wave波幅和潜伏期的变化结扎1根组和2根组血管时，结扎后并未见到F波的变化；结扎3根组、4根组和5根组血管时，结扎后F波的变化表现：潜伏期出现延长和波幅出现降低(图2～图6)，血管结扎后2 h和2 d的F波的潜伏期、波幅见表1～表2。

2.5 腰髓病理切片组织形态学观察对照组、1根组和2根组的脊髓组织，在光镜下观察时发现组织结构保持完整，神经元形态正常(图7)；3根组脊髓组织镜下示结构基本完整，可见点灶状变性、坏死，脊髓灰质可呈轻度水肿样改变，并可见大量正常形态的神经元，个别的神经细胞可出现细胞体积缩小、核固缩、核染色质的密度增高呈凋亡样变；5根组脊髓的正常结构基本消失，且广泛肿胀，并出现大量的空泡变性，正常的神经细胞极少，大量的神经细胞的胞核萎缩或者溶解，胞质呈嗜伊红染色，胞质中尼氏体消失(图8)；4根组介于3根组与5根组脊髓损伤之间。

图1 典型的F波波形

图2 1根组腰动脉结扎前后的F波

图3 2根组腰动脉结扎前后的F波

图4 3根组腰动脉结扎前后的F波

图5 4根组腰动脉结扎前后的F波

图6 5根组腰动脉结扎前后的F波

表1 各组F-wave波不同时间点潜伏期(ms，)

表1 各组F-wave波不同时间点潜伏期(ms，)

组别对照组1根组2根组3根组4根组5根组只数5 4 5 5 5 4手术前10.2±0.9 11.0±1.7 11.1±1.4 12.1±1.7 11.4±1.5 11.2±1.3结扎后2 h 10.4±0.8 10.9±1.7 11.1±1.5 12.5±1.8 13.6±1.6 /结扎后2 d 10.1±1.0 11.0±1.7 11.2±1.4 12.6±1.7 13.4±1.6 / F值0.102 0.001 0.010 0.134 2.756 / P值＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05 /

表2 各组F-wave波不同时间点波幅（%，)

表2 各组F-wave波不同时间点波幅（%，)

注：a与对照组比较，aP＜0.05；b与结扎前比较，bP＜0.05。

组别对照组1根组2根组3根组4根组5根组F值P值只数5 4 5 5 5 4手术前100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 F值2.506 0.075 0.715 16.090 79.275 P值＞0.05＞0.05＞0.05＜0.05＜0.05 / /结扎后2 h 99.5±0.9 100.2±2.1 98.4±3.5 76.9±8.1ab33.9±10.4ab0.0±0.0a222.491＞0.05结扎后2 d 102.4±3.8 100.4±1.1 99.8±1.7 81.2±8.7ab42.3±11.7ab0.0±0.0a178.000＞0.05 // / // /

2.6 脊髓运动功能评分结果对照组、1根组、2根组、3根组、4根组、5根组血管结扎在麻醉清醒后和血管结扎后2 d的运动功能评分，见表3。

图7 对照组骶髓HE切片（×200）

图8 实验组5根组骶髓HE切片（×200）

表3 各组脊髓运动功能评分()

表3 各组脊髓运动功能评分()

注：a与对照组比较，P＜0.05；b与结扎前比较，P＜0.05。

组别对照组1根组2根组3根组4根组5根组F值P值只数F值P值5 4 5 5 5 4手术前5.0±0.0 5.0±0.0 5.0±0.0 5.0±0.0 5.0±0.0 5.0±0.0 / / / / / /＜0.05＜0.05＜0.05手术后2 d 5.0±0.0 5.0±0.0 5.0±0.0 4.6±0.5 2.4±0.5ab0.3±0.5ab116.725＜0.05 / /手术后2 h 5.0±0.0 5.0±0.0 5.0±0.0 3.6±0.5ab1.4±0.5ab0.0±0.0 187.511＜0.05 13.000 86.333 381.000 / / / /

2.7 实验组各组术后2 h F波波幅变化与下肢运动功能的关系实验组的各组术后2 h F波的波幅变化与麻醉清醒后下的运动功能经Pearson相关性分析呈正相关，r值为0.955，差异均有统计学意义(P＜0.01)；实验组各组术后2 h F波波幅变化与术后2 d下肢运动功能经Pearson相关性分析呈正相关，r值为0.952，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)。

3 讨论

造成组织或者器官的不可逆性损伤的一个重要因素就是组织或细胞长时间的缺血缺氧。Tator等[5]认为脊髓组织及细胞的缺血缺氧改变在脊髓继发性损伤中有极其重要的地位，脊髓组织及细胞的缺血缺氧性改变可以通过脊髓神经的功能、脊髓组织的病理改变以极脊神经的电生理反映出来。脊柱或脊髓外伤、脊柱畸形的矫形手术、椎管或者髓内占位的手术治疗以及胸腹主动脉瘤的切除或修复术等，这些疾病或疾病的手术治疗过程中都会因术中操作不慎或者术后过度牵拉组织、血管等，从而导致脊髓供血动脉的损伤，这些损伤使原本就处于缺血缺氧状态的脊髓组织愈发无法获得足够的氧气，造成脊髓不可逆性的损伤。脊髓缺血性损伤所导致的机体截瘫、大小便失禁以及性功能障碍等伤残明显的降低了患者的生活质量。脊髓损伤在手术中的预防以及在临床治疗上的进步需要依赖于脊髓实验研究的发展，然而成功的实验研究又需要依赖于理想动物模型的建立[6]。大量的文献及其实验研究认为：脊髓损伤理想的动物模型既需要能够反映人类脊髓损伤的特点，又便于实验者进行观察且能够施加各种干预措施，使模型更好的为实验服务。

在动物实验中经常使用的脊髓损伤动物模型评估方法包括各种主观的脊髓功能评分、通过电生理监测数据进行评估和通过脊髓的病理分子生物学实验进行评估等。其中电生理监测指标评估包括以下几个方面：运动诱发电位、感觉诱发电位及球海绵体括约肌反射等。运动诱发电位可以用来评估脊髓的运动传导通路的完整性，脊髓的感觉传导通路是否完整是通过感觉诱发电位来评估的，通过球海绵体括约肌反射既可以评估骶神经的感觉、运动功能，又可以反映骶髓神经元的功能状态[7]。多种研究资料表明可以应用F波对整个脊髓运动神经通路的功能状态进行评估，包括运动神经根及运动神经元的功能。前期研究表明沿头尾方向依次对兔子左肾动脉和动脉分叉之间的不同水平的腰动脉进行结扎，可以建立不同程度的腰髓缺血损伤动物模型[8]，该动物模型克服了传统腹主动脉结扎所建立动物模型的各种下肢肌肉等组织的缺血性改变和上肢及心脏瘀血性等并发症的发生[9]，本实验我们应用F波对该模型进行进一步的评估。

脊髓前角运动神经元兴奋性的高低可以通过电生理监测仪器中F波波幅改变的灵敏度来反映出来，当脊髓前角运动神经元受到损害时，F波的波幅瞬时降低；脊髓运动神经根的功能是否完整可以根据F波潜伏期的变化进行判断，当脊髓运动神经根受到损伤时可以导致F波潜伏期明显延长[3]。本实验通过应用F波评估不同水平上的腰动脉结扎时所建立的不同程度的永久性脊髓缺血损伤的动物模型，结果表明F波的潜伏期不能够反映不同水平腰髓缺血损伤的程度，各组腰动脉结扎前后不同时间点的潜伏期经方差分析差异无统计学意义(P＞0.05)。F波的波幅对脊髓缺血敏感，能够灵敏的反映出不同水平腰髓缺血性损伤的程度，各组脊髓缺血动物模型随着缺血程度的增加F波的波幅逐渐下降并最终消失，腰动脉结扎3根组、4根组和5根组在结扎前后不同时间点的波幅经方差分析差异有统计学意义(P＜0.05)。

总之，通过刺激兔下肢胫后神经在跖肌可以记录到稳定的F波；F波潜伏期变化不能够反映不同水平腰髓缺血损伤的程度；F波的波幅变化能够反映出不同水平腰髓缺血损伤的程度并且能够预测脊髓的功能。

参考文献

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[3]Alemdar M.Value of F-wave studies on the electrodiagnosis of carpal tunnel syndrome[J].Neuropsychiatr Dis Treat,2015,31(11): 2279-2286.

[4]Li X,Fisher M,Rymer WZ,et al.Application of the F-Response for Estimating Motor Unit Number and Amplitude Distribution in Hand Muscles of Stroke Survivors[J].IEEE Transactions on Neural Systems&Rehabilitation Engineering,2015,24(6):674-681.

[5]Tator CH,Fehlings MG.Review of the secondary injury theory of acute spinal cord trauma with emphasis on vascular mechanisms[J]. Journal of Neurosurgery,1991,75(1):15.

[6]Deng J,Zhang Y,Wang L,et al.The effects of Glivec on the urinary bladder excitation of rats with suprasacral or sacral spinal cord transection[J].J Surg Res,2013,183(2):598-605.

[7]Niu X,Wang X,Ni P,et al.Bulbocavernosus reflex and pudendal nerve somatosensory evoked potential are valuable for the diagnosis of cauda equina syndrome in male patients[J].Int J Clin Exp Med, 2015,8(1):1162-1167.

[8]宋启民,杨卫忠,陈春美,等.不同程度永久性脊髓缺血动物模型的建立[J].中华实验外科杂志,2010,27(2):265.

[9]宋启民,费昶,杨卫忠,等.经颅电刺激运动诱发电位对脊髓缺血的监测作用[J].中华实验外科杂志,2011,28(3):478.

Value of F-wave in evaluating lumbar spinal cord injury in rabbit models of different levels of permanent spinal cord ischemia.

LUAN Jin-li1,YANG Chuan-chao1,SONG Qi-ming2,CHENG Yan-hao2,FEI Chang2,ZHANG Jian2.1. Weifang Medical College,Weifang 261053,Shandong,CHINA;2.Department of Neurosurgery,Linyi People's Hospital, Linyi 276000,Shandong,CHINA

ObjectiveTo investigate the evaluating effect of F-wave of posterior tibial nerve of rabbits on the different levels of lumbar spinal cord ischemic injury in animal models.MethodsThirty New Zealand white rabbits were divided into 6 groups by complete randomization,with one of them as the control group,the other five groups as experimental group.The control group(n=5)was used to determine the best stimulus intensity and eliminate the influence of anesthesia and surgery on F-wave;the rats in the five experimental groups(n=5)were ligated in the different levels of lumbar arteries in the left renal artery and arterial bifurcation.The changes of F-wave 2 h and 2 d after ligation were recorded.The motor functions were scored after anesthesia recovery and 2 d after operation.The correlation between the changes of F-wave amplitude 2 h after operation in the experimental groups and lower limb motor function was analyzed.Specimens in the central ischemic region were collected for HE staining to observe the pathological changes in ischemic area.ResultsThere was no significant change(P＞0.05)in the F-wave amplitude before and after ligation of one or two lumbar arteries,and analysis of variance at different time points before and after ligation showed no statistically significant difference(P＞0.05).The F-wave amplitude was decreased when three or four or even five lumbar arteries were ligated,and analysis of variance at different time points in each groups before and after ligation showed statistically significant difference(P＜0.05).The latency of F-wave has no significant change(P＞0.05)before and after ligation of one or two lumbar arteries,but it was gradually prolonged with the increase of the degree of ischemia when three or four or five lumbar arteries were ligated.Analysis of variance at different time points in each groups showed no statistically significant difference in the latency of F-wave(P＞0.05).ConclusionThe lumbar spinal cord ischemic injury cannot be accurately quantified through the latency of F-wave in posterior tibial nerve of rabbits,but the latency of F-wave would be extended when spinal cord ischemia was severe.The amplitude of F-wave can reflect the degree of lumbar spinal cord injury and predict the function of the spinal cord.

F-wave;Spinal cord;Ischemia;Lumbar artery;Rabbits

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.08.004

R-332

A

1003—6350（2017）08—1215—05

2016-11-13)

山东医药卫生科技发展计划面上项目（编号：2015WS0375）

宋启民。E-mail：1289477131@qq.com