LncRNA GAS5对结肠癌细胞生长及化疗药物作用的影响

李秋娴，朱剑霞，古裕莲，吕玉冰

(广州市番禺区中心医院检验科，广东广州511400)

LncRNA GAS5对结肠癌细胞生长及化疗药物作用的影响

李秋娴，朱剑霞，古裕莲，吕玉冰

(广州市番禺区中心医院检验科，广东广州511400)

目的检测长链非编码RNA生长抑制特异因子5(Lnc RNA GAS5)对结肠癌细胞的凋亡和生长的影响及其与化疗药物的敏感性是否有关联。方法siRNA干扰结肠癌细胞株SW480 LncRNA GAS5基因，检测细胞的存活率，加入化疗药物5氟尿嘧啶(5-FU)，检测细胞的克隆形成能力，流式细胞仪检测干扰前后细胞的凋亡。结果siRNA干扰结肠癌细胞SW480 LncRNA GAS5基因后，加入化疗药物5氟尿嘧啶，敲除GAS5基因后癌细胞存活率比敲除GAS5基因前多，其差异具有统计学意义(P＜0.05)；敲除GAS5基因后，结肠癌细胞的克隆形成能力比敲除GAS5基因前强，其差异具有统计学意义(P＜0.05)；流式细胞仪检测敲除GAS5前后的结肠癌细胞，敲除GAS5后结肠癌细胞凋亡数量降低，其差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论GAS5可促进结肠癌细胞的凋亡；GAS5能促进化疗药物对结肠癌细胞的作用；GAS5可能作为抑癌基因存在于结肠癌细胞中，为结肠癌的分子靶向治疗提供依据。

结肠癌；LncRNA GAS5；凋亡；增殖；5氟尿嘧啶

近年来的研究表明，长链非编码RNAs具有调节多种生物过程的潜能，它们在多种肿瘤中存在异常表达。LncRNAs通过多种途径参与基因表达，包括基因转录、翻译和染色体重构[1]。研究表明许多人类疾病与lncRNAs的异常表达有关，特别是肿瘤。在多种肿瘤中发现LncRNAs存在异常调节，提示LncRNAs可能作为潜在的致癌或抑癌RNAs[2]。

生长抑制特异因子5(growth arrest-specific 5 GAS5)在内显子中编码多种核RNA，在外显子中产生LncRAN。已证实GAS5在肾癌细胞株A498中低表达，上调GAS5的表达可抑制癌细胞的增殖，促进癌细胞凋亡和细胞周期停滞[3]。GAS5在前列腺癌细胞的表达与其细胞凋亡有关，转染质粒或小干扰RNA后，GAS5表达增高，细胞凋亡增加及细胞生存率下降[4]。GAS5在乳腺癌组织中表达低于正常组织，并可独立地诱导乳腺癌细胞生长停滞，促进凋亡[5]。有文献报道GAS5的低表达会导致抑制血细胞的凋亡及加速细胞周期的进程，其正常表达是保持T细胞系的正常生长死亡及维持外周血T淋巴细胞稳定的必要因素，它在细胞凋亡和细胞周期中的调控作用具有重大的意义[6]。有研究称GAS5促进细胞凋亡是通过诱导糖皮质激素效应器作用于糖皮质激素受体DNA结合域，令其缺乏营养或生长因子[7]。本研究通过敲除结肠癌细胞株SW480 LncRNA GAS5，研究LncRNA GAS5在结肠癌细胞的凋亡、增殖和对化疗药物的敏感性，为结肠癌的分子靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 SiRNA干扰GAS5基因培养结肠癌细胞SW480，在细胞达到对数增长期时开始实验，制备细胞悬液5 000个/ML，接种到6孔板中，每孔做2个重复，37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁培养4 h后用质粒转染SW620细胞。SiRNA引物5'-AGCTGGAAG TTGAAATGG，3'-CAAGCCGACTCTCCATACC，苏州吉码生物科技有限公司。

1.2 半数致死量确定制备细胞悬液5 000个/mL，接种到96孔板中，每孔约100 μL细胞悬液，每孔做3个重复，37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁培养4 h，加入不同浓度的毒性物质，37℃培养箱中培养7 d，加入10 μL CCK8，孵化2 h，测定450 nm吸光度。

1.3 细胞活性检测在96孔板中接种细胞悬液(100 μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养(在37℃，5%CO2的条件下)；向每孔加入10 μL的CCK8溶液；将培养板在培养箱内孵育1～4 h；用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.4 平板克隆抑制试验取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用；将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50个、100个、200个细胞的梯度密度分别接种并轻轻转动，使细胞分散均匀；置于37℃，5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周；弃去上清液，用磷酸盐缓冲液(PBS)小心浸洗2次；加4%多聚甲醛固定细胞5 mL固定15 min；然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30 min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥，拍照。随后加入10%冰醋酸溶液2 mL，静置30 min，待结晶紫溶解后，取100 μL加入96孔板中，酶标仪读取各孔560 nm波长处A值并计算克隆抑制率。克隆抑制率(%)=(对照组A560-加药组A560)/对照组A560×100%。

1.5 凋亡试验用不含EDTA的胰酶消化细胞后收集细胞；用预冷的PBS洗涤细胞2次，收集1～5× 105细胞；加入100 μL 1×Binding Buffer重悬细胞；加入5 μLAnnexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution，轻轻混匀；避光、室温反应10 min；加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀，样品在1 h内用流式细胞仪或荧光显微镜检测，重复3次，取均值。

1.6 统计学方法应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差()表示，组间比较采用两样本均数t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5-FU半数致死量的确定5-FU对SW480细胞的半数致死量的确定，最终可得出LD50=94 ng/mL，见图1。

图1 5-FU半数致死量的确定

2.2 SiRNA对细胞活力的影响转染小干扰RNA后，细胞活力和转染前细胞差异无统计学意义(P＞0.05)，由此得出SiRNA对细胞活力并无明显伤害和影响，见图2。

图2 SiRNA对细胞活力的影响

2.3 5-FU对转染前后结肠癌细胞存活率的影响加入半数致死量的5-FU，转染前细胞的存活率低于SiRNA干扰GAS5基因后的细胞，其差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

2.4 平板克隆抑制试验SiRNA干扰GAS5基因后加入化疗药物5-FU，细胞的集落形成能力比干扰前增加，溶解结晶紫后，A560分别为(3.7±0.97)和(5.3± 1.01)，克隆抑制率为-(43.17±1.05)%，差异有统计学意义(P＜0.05)，证明GAS5在化疗药物的作用下可加快细胞的凋亡，降低增殖，见图4。

2.5 流式细胞仪检测细胞的凋亡SiRNA干扰GAS5基因后，加入化疗药物5-FU，细胞的凋亡率为(2.01±0.27)%，比干扰前的(20.21±1.32)%减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，证明GAS5可促进化疗药物对肿瘤细胞的作用，见图5。

图3 5-FU对细胞存活率的影响

图4 平板克隆抑制试验

图5 转染前后的细胞凋亡

3 讨论

长链非编码RNAs被普遍认为是非蛋白编码RNA，其分子量大于200 bp，具有调节多种生物过程的潜能，它们在多种肿瘤中存在异常表达。LncRNAs逐步被证实为人类恶性肿瘤形成的重要的基因表达调控器，GAS5是一长链非编码RNA，已在多种肿瘤组织中被检测到低量表达，它具有促进细胞凋亡，使细胞周期停滞的功能，细胞凋亡受抑制将导致细胞生存期延长，并使突变的细胞继续生长，最终导致肿瘤的发生。GAS5在胃癌组织中的表达要低于正常组织，敲除GAS5可增加YBX1蛋白的转化从而废除胃癌细胞细胞周期的G1相时间，从而抑制胃细胞的癌变[8]。在恶性胸膜间皮瘤细胞中，lncRNA GAS5表达增加可增强启动子活性，沉默GAS5可增加糖皮质激素反应体诱导激活亮氨酸拉链和糖皮质激素调节激酶-1的表达并缩短细胞循环[9]。GAS5在外周血的表达稳定表达，非小细胞肺癌患者的外周血表达GAS5要明显低于健康人群血清，术后表达GAS5比术前要明显增多[10]。GAS5在非小细胞肺癌组织中的表达要明显低于正常组织[11]。有研究把高表达GAS5的黑色素瘤细胞和敲除GAS5的黑色素瘤注入裸鼠后对比肿瘤组织的体积和重量，表明了GAS5在黑色素瘤细胞的转移和发展中起抗癌作用[12]。本研究用小干扰RNA沉默结肠癌细胞株SW480 GAS5后，细胞的凋亡减少，克隆形成能力增加，加入5-FU后，敲除了GAS5基因的结肠癌细胞存活率比敲除GAS5基因前强，凋亡数量减少，从而验证了GAS5在肿瘤细胞的生长发育，细胞增殖、凋亡中可能是以抑癌基因参与细胞功能的调节，促进细胞凋亡，并增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。肿瘤的形成是多基因多因素导致的，致癌基因的激活、抑癌基因的受抑制是从分子生物学水平研究肿瘤的方向，本实验显示了GAS5基因在肿瘤发生发展中可能的角色，为肿瘤的分子靶向治疗提供了依据。

[1]Wilusz JE,Sunwoo H,Spector DL.Long noncoding RNAs:functional surprises from the RNA world[J].Genes Dev,2009,23(13): 1494-1504.

[2]Gibb EA,Brown CJ,Lam WL.The functional role of long non-coding RNAin human carcinomas[J].Mol Cancer,2011,10:38.

[3]Qiao HP,Gao WS,Huo JX,et al.Long non-coding RNA GAS5 functions as a tumor suppressor in renal cell carcinoma[J].Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(2):1077-1082.

[4]Pickard MR,Mourtada-Maarabouni M,Williams GT.Long non-coding RNA GAS5 regulates apoptosis in prostate cancer cell lines[J]. Biochim BiophysActa,2013,1832(10):1613-1623.

[5]Mourtada-Maarabouni M,Pickard MR,Hedge VL,et al.GAS5,a non-protein-coding RNA,controls apoptosis and is downregulated in breast cancer[J].Oncogene,2009,28(2):195-208.

[6]Mourtada-Maarabouni M,Hedge VL,Kirkham L,et al.Growth arrest in human T-cells is controlled by the non-coding RNA growth-arrest-specific transcript 5(GAS5)[J].J Cell Sci,2008,121(Pt 7): 939-946.

[7]Kino T,Hurt DE,Ichijo T,et al.Noncoding RNA gas5 is a growth arrest-and starvation-associated repressor of the glucocorticoid receptor[J].Sci Signal,2010,3(107):ra8.

[8]Liu Y,Zhao J,Zhang W,et al.lncRNA GAS5 enhances G1 cell cycle arrest via binding to YBX1 to regulate p21 expression in stomach cancer[J].Sci Rep,2015,5:10159.

[9]Renganathan A,Kresoja-Rakic J,Echeverry N,et al.GAS5 long non-coding RNA in malignant pleural mesothelioma[J].Mol Cancer, 2014,13:119.

[10]Liang W,Lv T,Shi X,et al.Circulating long noncoding RNA GAS5 is a novel biomarker for the diagnosis of nonsmall cell lung cancer [J].Medicine(Baltimore),2016,95(37):e4608.

[11]Wu Y,Lyu H,Liu H,et al.Downregulation of the long noncoding RNA GAS5-AS1 contributes to tumor metastasis in non-small cell lung cancer[J].Sci Rep,2016,6:31093.

[12]Chen L,Yang H,Xiao Y,et al.LncRNA GAS5 is a critical regulator of metastasis phenotype of melanoma cells and inhibits tumor growth in vivo[J].Onco Targets Ther,2016,9:4075-4087.

Effect of LncRNA GAS5 on cancer cell survival and chemosensitivity in colon cancer.

LI Qiu-xian,ZHU Jian-xia, GU Yu-lian,LV Yu-bing.Department of Clinical Laboratory,Panyu District Central Hospital of Guangdong,Guangzhou 511400,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of LncRNA GAS5(growth arrest-specific 5)on apoptosis,cell viability and chemosensitivity of colon cancer.MethodssiRNA was used to interfere the expression of LncRNAs GAS5 in SW480 cell line.And the cell survival rate of the cells and the difference of the colony formation ability of the cells after 5 fluorouracil treatment was analyzed.Flow cytometry were introduced to evaluate the function of LncRNA GAS5 on apoptosis and chemosensitivity to 5 fluorouracil.ResultsAfter siRNA inference with SW480 LncRNA GAS5,5 fluorouracil treatment demonstrated cell viability significantly increased after GAS5 knockdown in SW480 cells compared with that before GAS5 knockdown(P＜0.05).Cell apoptosis rate reduced after GAS5 knockdown in SW480 cells(P＜0.05).Meanwhile flow cytometry detection showed colony formation ability significantly promoted(P＜0.05).ConclusionGAS5 could promote colon cancer cell apoptosis.GAS5 could promote the chemosensitivity of colon cancer cells to 5 fluorouracil.GAS5 may act as a tumor suppressor gene exists in colon cancer cells,and provide a new molecular therapy target for colon cancer.

Colon cancer;LncRNAGAS5;Apoptosis;Proliferation;5 fluorouracil

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.08.002

R735.3+5

A

1003—6350（2017）08—1209—03

2016-11-18)

广东省广州市番禺区科技信息局项目(编号：2014-Z03-066)

李秋娴。E-mail：178248744@qq.com