吉西他滨与奥曲肽联合应用对前列腺癌细胞PC-3的抑制作用

郝继东，孙福康

(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院泌尿外科，上海200025；2.上海健康医学院附属周浦医院泌尿外科，上海201318)

吉西他滨与奥曲肽联合应用对前列腺癌细胞PC-3的抑制作用

郝继东1,2，孙福康1

(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院泌尿外科，上海200025；2.上海健康医学院附属周浦医院泌尿外科，上海201318)

目的研究吉西他滨与奥曲肽联合用药对去势抵抗性前列腺癌细胞PC-3增殖的抑制作用及对凋亡的影响。方法体外培养人前列腺癌细胞株PC-3，应用MTT细胞实验研究空白组、对照组、不同浓度的奥曲肽组(0.5µg/mL、1µg/mL、2µg/mL、4µg/mL、8µg/mL)与吉西他滨组(1µg/mL)单独使用以及联合使用不同时间段对PC-3细胞增殖抑制的影响；应用流式细胞仪检测对照组、奥曲肽组(8µg/mL)与吉西他滨组(1µg/mL)单独使用及联合使用对PC-3细胞凋亡的影响；并用Western-blot实验研究对照组、奥曲肽组(8µg/mL)与吉西他滨(1µg/mL)单独使用及联合使用对凋亡指标Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase9表达的影响。结果MTT细胞实验显示，联合用药组作用72 h后，抑制率可达62%，显著高于对照组、奥曲肽组和吉西他滨组，差异均有显著统计学意义(P＜0.05)；AnnexinV-FITC细胞凋亡实验结果表明，联合用药组凋亡率25%，显著高于对照组、奥曲肽组和吉西他滨组，差异均有显著统计学意义(P＜0.05)；Western-blot结果显示，联合用药组Bcl-2表达低于对照组、奥曲肽组和吉西他滨组，而其Bax，Caspase3、Caspase9蛋白表达量显著高于对照组、奥曲肽组和吉西他滨组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论吉西他滨和奥曲肽可以协同作用，增强对去势抵抗性前列腺癌细胞系PC-3的增殖抑制和促凋亡作用，提示临床上两者联合应用于去势抵抗性前列腺癌治疗的可行性。

吉西他滨；奥曲肽；前列腺癌；增殖；凋亡

奥曲肽是一种八肽生长抑素类似物，在临床上广泛应用于急性重症出血症和胰腺炎的治疗。近年来，随着对生长抑素在抗肿瘤方面机制的进一步研究，奥曲肽在肿瘤治疗方面的研究也逐渐增多。Teunissen等[1]应用奥曲肽治疗Hurthle细胞甲状腺癌，肿瘤体积明显缩小。Bodei等[2]对21例甲状腺髓样癌应用奥曲肽治疗2～8周后，67%的患者得到治愈或缓解。Schmitt等[3]报道，注射奥曲肽治疗一周后，鼠荷小细胞肺癌模型的肿瘤明显缩小。吉西他滨是一种二氟核苷类抗代谢物抗癌药，临床应用于治疗非小细胞肺癌及胰腺癌等。吉西他滨与奥曲肽联合用药在多种癌症中都有很好疗效，但对于前列腺癌的作用却没有报道。本研究选择人去势抵抗性前列腺癌细胞系PC-3为研究对象，探究吉西他滨和奥曲肽联合用药及单独用药对PC-3细胞的增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂人去势抵抗性前列腺癌细胞系PC-3购自中国科学院生物化学所。DMEM培养基、胰酶、胎牛血清购自Gibco公司。PMSF购自Amresco公司。RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、MTT试剂盒购自碧云天生物有限公司。DMSO、青霉素、链霉素购自Sigma公司。吉西他滨购自江苏豪森药业公司，奥曲肽购自上海第一生化药业有限公司。Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase9抗体购自Santa Cruze公司。

1.2 PC-3细胞培养PC-3细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基(含100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素)中，37℃，5%CO2条件下扩增。细胞增殖到接触抑制，以0.25%胰蛋白酶消化传代。细胞用药分为空白对照组、奥曲肽组、吉西他滨组和联合用药组。

1.3 MTT细胞实验将PC-3细胞培养于含10% FBS的DMEM培养液中，待细胞长满培养瓶90%时用胰酶消化后血球计数板计数，调整细胞悬液浓度，每孔加入细胞培养液定容至100µL，96孔板每孔5 000个细胞，设3个复孔。每3 d换液一次。置于37℃、5%CO2恒温箱中培养24 h。将奥曲肽，0.5µg/mL、1.0µg/mL、2.0µg/mL、4.0µg/mL、8.0µg/mL，及吉西他滨1µg/mL及吉西他滨1µg/mL加奥曲肽各浓度组按照事先约定的浓度加入至相应孔中，同时设置空白组(没有PC-3细胞，只加入相同量的培养基和MTT及DMSO)、对照组(PC-3细胞、相同浓度的药物溶解介质、细胞培养液、MTT和DMSO)，每组设五个复孔。分别培养24 h、48 h和72 h后小心吸去上清，加入80 μL新鲜培养液，再加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，并继续培养4 h。然后吸掉上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪570 nm处测量各孔的吸光值。计算抑制率%=[(对照-空白)-(给药-空白)]/(对照-空白)×100%

1.4 AnnexinV-FITC细胞凋亡实验细胞分组为：对照组(正常培养的PC-3细胞)、奥曲肽组(8.0µg/mL)、吉西他滨组(1µg/mL)和联合用药组(奥曲肽8µg/mL+吉西他滨1µg/mL)作用细胞72 h。收集细胞，PBS重悬细胞并计数。取5～10万细胞，1 000 r/min离心5 min后弃上清，加入195 μLAnnexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5 μLAnnexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育10 min。1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入190 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入10 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

1.5 Western-blot实验各组作用细胞72 h用含PMSF裂解液裂解细胞，10 000 g离心10 min，取上清。用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白上样量定于20 μg与上样缓冲液混合，煮沸5 min，离心。上样进行SDS-PAGE凝胶电泳。400 mA转膜2 h，5%脱脂牛奶封闭过夜，一抗孵育1 h，TTBS清洗3次，每次10 min，二抗孵育1 h，TTBS清洗3次，每次10 min。ECL发光，显影。

1.6 统计学方法应用SPSS16.0统计学软件包统计，计量资料以均数±标准差()表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 奥曲肽、吉西他滨及联合用药对PC-3细胞增殖的作用由图1结果可见，MTT细胞实验显示，奥曲肽对PC-3细胞的抑制率与浓度和作用时间呈正相关，随浓度的增加和作用时间的延长，抑制率逐渐增加，在8 μg/mL浓度下作用72 h，抑制率可达到46%。1 μg/mL吉西他滨单独作用抑制率可达到26%，而联合用药在每个时间点相对于单独用药，抑制率都有明显的上升，联合用药作用72 h后，抑制率可达到62%。

图1 奥曲肽、吉西他滨及联合用药对PC-3细胞增殖的抑制率

2.2 AnnexinV-FITC细胞凋亡实验由图2及图3结果可见，对照组凋亡率显著低于其他各处理组，联合用药组凋亡率显著高于对照组，吉西他滨组凋亡率显著高于其他各处理组，但低于联合用药组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 Western-blot检测凋亡相关蛋白表达由图4和图5可见，对照组Bcl-2蛋白表达量显著高于其他组，联合用药组的Bcl-2，蛋白表达量显著低于其他组，对照组Bax、Caspase3、Caspase9蛋白表达量显著低于其他组，联合用药组的Bax、Caspase3、Caspase9蛋白表达量显著高于其他组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

图2 对照组、奥曲肽组、吉西他滨组及联合用药组PC-3细胞凋亡的流式细胞图

图3 对照组、奥曲肽组、吉西他滨组及联合用药组对PC-3细胞凋亡的影响

图4 对照组、奥曲肽组、吉西他滨组和联合用药组Western-Bolt实验结果

图5 对照组、奥曲肽组、吉西他滨组和联合用药组对PC-3细胞凋亡相关蛋白表达的影响

3 讨论

前列腺癌在当前世界上位居发达国家男性肿瘤发病率的首位，在我国，其发病趋势也是不断上升[4-6]。常规化疗药物对去势抵抗性前列腺癌效果不佳，因此，寻求更佳的化疗药物一直是前列腺癌治疗的研究热点。

奥曲肽是人工合成的8个氨基酸的生长抑素类似物，可以作用于肿瘤细胞，使细胞周期停滞在G0/G1期，抑制肿瘤细胞增殖，并促进细胞凋亡。吉西他滨是脱氧胞苷的类似物，可以抑制核糖核苷酸还原酶的活性，从而阻断肿瘤细胞DNA复制，抑制细胞增殖。前列腺癌治疗涉及多个方面，单从一个角度治疗效果不佳，因此，目前临床上多采用多种药物联合治疗。奥曲肽和吉西他滨联合用药对胰腺癌、非小细胞肺癌都有不错的效果，因此本文对两者联合用药对前列腺癌细胞株PC-3的作用做了研究。

本研究MTT细胞实验显示，奥曲肽对PC-3细胞的抑制增殖作用随时间增长和药物浓度增加而逐步提高，但抑制率始终徘徊在50%以下，而吉西他滨单独用药，只可达到22%左右的抑制率，两者单独作用效果不佳。奥曲肽各个浓度与吉西他滨联合使用后抑制率普遍高于单独使用，并在72 h，8 μg/mL的药物浓度作用下，使抑制率达到60%以上。流式细胞术检测凋亡的结果反映了两种药物对PC-3细胞凋亡的影响，单独用药，奥曲肽和吉西他滨只能促使PC-3细胞凋亡比率为10%～15%，凋亡细胞数目不多，而联合用药72 h后凋亡细胞的比率显著上升，达到接近30%的水平。为了进一步证明对细胞凋亡的影响，我们检测了细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase9的表达。从结果来看，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达在联合用药作用下抑制明显，而Bax促凋亡基因的表达显著升高。细胞发生凋亡程序后，Caspase3、Caspase9表达上升，促使细胞进行凋亡程序。

从以上结果可以看出，奥曲肽和吉西他滨联合用药，对于PC-3前列腺癌细胞株具有显著的抑制作用，并促使PC-3细胞凋亡，这对临床进行联合用药治疗前列腺癌具有重要的指导作用。

[1]Teunissen JJ,Kwekkeboom DJ,Kooij PP,et al.Peptide receptor radionuclide therapy for non-radioiodine-avid differentiated thyroid cancer[J].J Nucl Med,2005,46:107-114.

[2]Bodei L,Haudkiewiez-Junak D,Grana C,et al.Receptor radionuclide therapy with 90Y-DOTATOC in patients with medullary thyroid carcinomas[J].Cancer Biother Radiophasm,2004,19(1):65-71.

[3]Schmitt A,Bemhardt P,Nilsson O,et al.Radiation therapy of small cell lung cancer with Lu-DOTA-octreotate in an animal model[J].J NucI Med,2004,45(9):1542-1548.

[4]Bushemeyer WC 3rd,Freedland SJ.Obesity and prostate cancer:epidemiology and clinical implications[J].Eur Urol,2007,52(2): 331-343.

[5]侯振江,李永乾.蛋白质组学及其在前列腺癌研究中的应用[J].中华男科学杂志,2006,12(4):358-361.

[6]甘琳,李鸣.雄激素非依赖性前列腺癌发病机制的研究进展[J].中华外科杂志,2007,45(8):562-564.

Synergistic inhibition effects of gemcitabine and octreotide on prostate cancer cell line PC-3.

HAO Ji-dong1,2,SUN Fu-kang1.1.Department of Urology,Ruijin Hospital Affiliated to School of Medicine of Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025,CHINA;2.Department of Urology,Zhoupu Hospital Affiliated to Shanghai Health University of Medicine, Shanghai 201318,CHINA

ObjectiveTo study the inhibitory effects of gemcitabine cooperated with octreotide on castration resistant prostate cancer cells PC-3 proliferation and the influence on apoptosis.MethodsHuman prostate cancer cell line PC-3 was cultured in vitro in order to investigate the effects of octreotide(0.5µg/mL,1µg/mL,2µg/mL,4µg/mL, 8µg/mL)and gemcitabine(1 μg/mL)alone or combination on proliferation inhibition and apoptosis-inducing ability in different periods of time.Flow cytometry was applied to study the effects of octreotide(8µg/mL)and gemcitabine (1 μg/mL)alone or combination on PC-3 cell apoptosis.And Western-blot technique was utilized to evaluate the influence of octreotide(8µg/mL)and gemcitabine(1 μg/mL)alone or combination on expression of apoptosis indexes Bax, Bcl-2,Caspase3 and Caspase9.ResultsMTT cell test results showed that after 72 hours,the inhibition ratio was 62% in combined treatment group,significantly higher than that in the single drug group and control group,showing the differences were statistically significant(P＜0.05).AnnexinV-FITC cell apoptosis experiment results showed that the apoptosis rate in combined treatment group(25%)was significantly higher than that of the single drug group and control group,showing the differences were statistically significant(P＜0.05).Western-blot experiment results showed that the Bcl-2 in the combined treatment group was lower than that in other groups,and the expression of Bax,Caspase3 and Caspase9 protein were significantly higher than that in other groups,showing the differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionThe synergistic effect of octreotide and gemcitabine enhanced the proliferation inhibition and apoptosis promotion in human castration resistant prostate cancer cell line PC-3,suggesting that the clinical combination should be feasible for the treatment of castration resistant prostate cancer.

Gemcitabine;Octreotide;Prostate cancer;Proliferation;Apoptosis

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.08.003

R737.25

A

1003—6350（2017）08—1212—03

2016-09-04)

上海市健康医学院附属周浦医院重点专科建设(编号：ZP-xk-2015C-1)

孙福康。E-mail：sunfukang6@126.com