外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD19+水平与喉癌患者预后的相关性

张国顺 黄晓阳 李守民

外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD19+水平与喉癌患者预后的相关性

张国顺 黄晓阳 李守民

目的 探讨喉癌患者免疫水平的变化与病情进展的关系。方法 选取56例喉癌患者，用流式细胞仪检测不同分组的喉癌患者外周血淋巴细胞和NK细胞的表达水平。结果 手术后患者CD19+显著性下降(P<0.05)，而NK细胞显著上升(P<0.05);有淋巴结转移的患者比无淋巴结转移的患者NK细胞上升，CD4+下降，二者均有统计学差异(P<0.05)；病理分期中Ⅲ～Ⅳ期的患者比Ⅰ～Ⅱ期表现出CD19+显著性下降(P<0.05)，CD4+则显著上升(P<0.05)。在术后随访18个月中，有复发或转移的患者比无转移且无复发患者CD4+下降，而NK细胞和CD19+上升，均具有统计学差异(P<0.05)。结论 喉癌患者免疫状态和病情之间有一定的联系。

喉癌；细胞免疫；NK细胞；流式细胞术

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:735～737)

喉癌(laryngeal cancer)是耳鼻咽喉头颈外科中常见的恶性肿瘤。近年来，在我国北方其新发病例数和死亡人数逐年增加，发病率和死亡率亦居高不下[1]。癌细胞淋巴结转移是导致恶性肿瘤复发和死亡的主要原因，同时也是影响喉癌患者预后的主要因素。研究显示[2]，细胞免疫在抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用，它通过功能不同的T细胞亚群完成免疫调控。CD8+淋巴细胞介导细胞毒效应在抗肿瘤免疫中起主要作用。CD4+细胞在细胞免疫和体液免疫起协助作用，CD3+仅存在于T细胞表面，故用作外周血所有成熟的T淋巴细胞的标记，CD19+则用作标记B淋巴细胞，NK细胞(natural killer cell)亦在细胞免疫中发挥重要作用。故本研究采用流式细胞术对56例喉癌患者术前和术后的外周淋巴细胞(CD8+、CD3+、CD4+、CD19+)以及自然杀伤细胞(NK细胞)的表达进行检测，从而探讨细胞免疫状态与病情的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2012年6月至2014年6月在我院就诊的喉癌患者共56例，其中男性47例，女性9例，年龄42～79岁，平均59.2岁；所有患者经手术后病理切片证实均为鳞状细胞癌，按国际喉鳞状细胞癌TMN分期法可分为：Ⅰ～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ期40例；根据术后病理是否有淋巴结的转移分为有淋巴转移47例，无淋巴结转移9例。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 COULTERRQ-PREP自动溶血仪、EPICS XL/XL-MCL流式细胞仪，均为美国Beckman公司产品。

1.2.2 试剂 鼠抗人单克隆抗体：CD8/CD45/CD4/CD3、CD45/CD19/CD(16±56)/CD45，肝素。所有试剂均为美国Beckman公司产品。

1.3 方法

喉癌患者均于术前及术后清晨空腹时，用真空采血管抽取外周血2.0 ml，肝素抗凝。取100 μl抗凝全血后分别加入CD8/CD45/CD4/CD3、CD45/CD19/CD(16±56)/CD45荧光标记的单克隆抗体2 μl，混匀。室温暗处反应30 min后加入细胞裂解液2.0 ml，待溶血后洗涤，用流式细胞仪检测NK细胞，CD19+、CD8+、CD4+及CD3+，根据二维双参数点图，先设“门框”于CD45细胞，对荧光标记的细胞数量进行分析，计算以下细胞表达百分比：CD8+、CD4+、CD3+、CD3+/CD16+CD15+、CD3+/CD19+以及CD4+/CD8+比值；术后随访18个月，观察统计患者是否有转移、复发，随访率为100%。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 喉癌患者手术前后淋巴细胞表达水平的比较

相比于手术前，手术后NK细胞表达水平升高，CD19+细胞表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05);而其它指标相比于术前无明显改变(P>0.05)，见表1。

表1 喉癌患者手术前后淋巴细胞表达水平的比较±s)

2.2 有无淋巴结转移的喉癌患者淋巴细胞表达水平的比较

与无淋巴结转移患者比较，有淋巴结转移的喉癌患者CD4+细胞表达水平下降，其NK细胞表达水平明显增高，差异均有统计学意义(P<0.05)；而其它指标无明显差异，P>0.05，见表2。

表2 喉癌患者有无淋巴结转移淋巴细胞表达水平 的比较

2.3 不同病理分期喉癌患者淋巴细胞表达水平比较

根据流式细胞仪结果可知，Ⅰ～Ⅱ期患者相比于Ⅲ～Ⅳ期喉癌患者CD19+细胞水平明显增高及CD4+细胞水平明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05);其它指标二者相比无明显差异，P>0.05，见表3。

表3 不同分期喉癌患者淋巴细胞表达水平 的比较

2.4 是否转移、复发的喉癌患者淋巴细胞表达比较

术后随访18个月，56例患者中有15例出现转移和复发现象。相比无转移或复发患者，有转移或复发患者中的CD19+、NK细胞均明显增高，其CD4+细胞表达水平明显降低(P<0.05);而其它指标相比于无转移或复发患者组无显著差异，P>0.05，见表4。

表4 有复发或转移与无转移且无复发的喉癌患者淋巴细胞 表达水平的比较±s)

3 讨论

流式细胞仪通过分析上万个细胞的侧向角散射、前向角散射和及光信号等参数，从而检测外周血淋巴细胞亚群的改变而动态评估机体免疫功能，从而反映肿瘤细胞的活性。对肿瘤患者进行机体免疫状态的检测具有便捷、快速、敏感且准确的特点，故其在评价疗效及判断预后中具有重要价值[3]。

从免疫学角度分析，机体具有自我免疫监视的功能，故可以及时清除癌变细胞，但肿瘤患者机体的肿瘤免疫逃逸作用及患者免疫监视系统的失调，而导致了肿瘤的发生、发展。在机体抗肿瘤免疫作用中，主要以T细胞、NK细胞和MΦ细胞的细胞免疫发挥重要作用[4-5]。有研究表明[6]，在喉癌患者中其外周血 CD8+淋巴细胞表达率明显高于常人，比较不同病理分级患者，CD8+细胞亦有显著性差异。再者，患者CD4+/CD8+比值显著性低于常人。故本研究通过检测外周血淋巴细胞亚群的变化以了解机体细胞免疫状态，从而判断患者细胞免疫与预后之间的关系。

本研究通过对喉癌患者外周血T淋巴细胞亚群的测定，我们发现，有淋巴结转移的喉癌患者外周血CD4+细胞表达水平比无淋巴结转移患者下降(P<0.05)；在不同病理分期中同样也观察到，病理分期Ⅲ～Ⅳ期喉癌患者的CD4+水平低于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)；此现象在术后18个月内有转移或复发的患者也显著低于无转移且无复发患者(P<0.05)，且比较文献，喉癌患者的CD8+细胞表达水平均高于健康常人，故可知，CD4+/CD8+比值高于健康常人。此外可观察到Ⅲ～Ⅳ期CD19+显著性低于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)，故可推测，因癌症的发生，患者的免疫功能抑制加重，细胞免疫受破坏同时体液免疫也呈现减弱趋势。细胞免疫受到抑制，随之其对癌细胞的清除能力也随之降低，从而也导致肿瘤的进一步发展。

自然杀伤细胞(NK细胞)又称大颗粒淋巴细胞(large granular lymphocytes，LGL)，是参与机体天然免疫的主要细胞，具有抗肿瘤、抗感染和免疫调节等功能[7]。NK细胞表面表达的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(inhibitory killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR)和活化性受体NKG2D是调节NK细胞杀伤活性的主要受体。NK细胞表面的活化性受体(KIR)与肿瘤细胞表面的相应配体结合，从而激活NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用取决于这两种受体识别相应配体后的综合作用结果[8]。NK 细胞不依赖抗体和补体，同时也不受主要组织相容复合物的限制，它通过分泌IL-2、GM-CSF、IFN-α和IFN-γ等细胞因子从而直接杀伤肿瘤细胞，成为肿瘤免疫的第一道防线。

本研究通过对喉癌患者自然杀伤细胞的检测，可以发现，相比于手术前，手术后喉癌患者的NK细胞显著性增高(P<0.05)，同样，对于有淋巴结转移的患者其NK细胞表达亦显著性增高(P<0.05)，在术后随访18个月中，发现有转移或复发的喉癌患者的NK细胞表达也显著性增高(P<0.05)，这些表明NK 细胞与肿瘤的进展之间具有一定关系。

机体的免疫机制会对肿瘤细胞做出应对，同时肿瘤对机体的抗肿瘤免疫功能产生影响，可知肿瘤的发生发展与免疫功能的强弱间具有一定的内在联系。本研究通过流式细胞仪对NK细胞，CD19+、CD8+、CD4+及CD3+监测，可有效地观察喉癌患者某一阶段的免疫功能的变化，对于喉癌患者的治疗和预后情况具有一定的临床意义。

[1] 刘权忠.CO2激光喉镜显微手术治疗早期声门型喉癌疗效观察〔J〕.安徽医药,2015,19(6):1167-1168.

[2] Elinav EL,Nowarski R,Thaiss CA,et al.Inflammation-induced cancer:crosstalk between tumours,immune cells and microorganisms〔J〕.Nat Rev Cancer,2013,13(11):759-771.

[3] 张艳桥.肿瘤自体细胞免疫治疗的临床应用情况〔J〕.中国医院用药评价与分析,2012,12(2):99-100.

[4] 陈 海,毛建平.肿瘤免疫逃逸与T淋巴细胞关系的研究进展〔J〕.中国生物工程杂志,2012,32(10):74-79.

[5] Mallappa S,Sinha A,Gupta S,et al.Preoperative neutrophil lymphocyte ratio greater than five is a prognostic factor for recurrent colorectal cancer〔J〕.Colorectal Dis,2013,15(21):323-328.

[6] 吴姗姗,严 峰,邓玉玲，等.小细胞和非小细胞肺癌晚期患者CD3+、CD4+及CD3+、CD8+T 淋巴细胞亚群的差异〔J〕.中国免疫学杂志,2015,31(2):114-121.

[7] Pietra G,Manzini C,Vitale M,et al.Natural killer cells kill human melanoma cells with characteristics of cancer stem cells〔J〕.Int Immunol,2009,21(7):793-801.

[8] 赵 艳,陈 伟.Pim-1激酶对小鼠CD4CD4,CD4,CD4,CD4.CD4CD4+T细胞分化的影响〔J〕.肿瘤药学,2016,6(1):35-38.

(编辑：甘 艳)

Relationship between the Levels of Peripheral Blood CD3+,CD4+,CD8+,CD19+and Prognosis of Laryngeal Cancer

ZHANGGuoshun，HUANGXiaoyang，LIShoumin.

AnyangDistrictHospital,Anyang，455000

Objective To study the relationship between the changes of immunity lever and progression of disease in patients with laryngeal cancer.Methods The levels of peripheral blood lymphocytes and the level of natural killer cell(NK) in the 56 patients were determined by Flow cytometry.Results The level of CD19+decreased while the level of NK cell increased in 56 patients after surgery(P<0.05).Compared to the patients without lymph node metastasis,the patients with lymph node metastasis had a increase in the level of NK cell and a decrease in the level of CD4+.Compare to the patients with stageⅠ～Ⅱ,the patients with stage Ⅲ～Ⅳ had a increase in the level of CD4+and a decrease in the level of CD19+(P<0.05).After 18 months follow-up,the recurrent or metastatic patients had increases in the level of NK cell and the level of CD19+while had a decrese in CD4+,compared to the patients who didn’t have any recurrence or metastasis(P<0.05).Conclusion There is a certain relationship between the changes of immunity lever and progression of disease in patients with laryngeal cancer.

Laryngeal cancer;Cellular immunity;Natural killer cell;Flow cytometry

455000 河南省安阳地区医院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.05.012

R739.65

A

1001-5930(2017)05-0735-03

2016-11-09

2017-03-23)