腹腔镜下射频消融联合静脉化疗对PTEN通路和Wnt通路介导肝癌细胞生长的影响

2017-05-09吴杭源陈卫吴鸣宇

中国内镜杂志 2017年4期

吴杭源，陈卫，吴鸣宇

（1.江苏省无锡市第五人民医院肝病科，江苏无锡 214005；2.江苏省无锡市第五人民医院肿瘤科，江苏无锡 214005；3.江苏省无锡市人民医院肝胆外科，江苏无锡 214021）

吴杭源1，陈卫2，吴鸣宇3

目的探讨腹腔镜下射频消融术（LRFA）联合静脉化疗对PTEN通路、Wnt通路介导肝癌细胞生长的影响。方法收集2013年5月-2016年6月该院收治的肝细胞癌患者90例，按照随机数表法分为观察组（n=45）及对照组（n=45）。观察组患者接受LRFA联合静脉化疗，对照组患者仅接受静脉化疗。术后1周取两组患者的肝脏病灶组织标本，采用逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）检测其中PTEN信号通路、Wnt信号通路相关基因mRNA表达量；采用放射免疫法检测血清肿瘤标志物含量。结果治疗1周后，观察组患者的病灶组织PTEN通路相关基因PTEN mRNA表达量高于对照组患者，缺氧诱导因子-1（HIF-1）和血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达量低于对照组患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；观察组患者的病灶组织Wnt通路相关基因β-链蛋白（β-catenin）、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、c-myc和基质金属蛋白酶7（MMP-7）mRNA表达量低于对照组患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；观察组患者的血清肿瘤标志物甲胎蛋白（AFP）、γ-谷胺酰转肽酶同工酶Ⅱ（GGT-Ⅱ）、胰岛素样生长因子-2（IGF-2）、糖类抗原19-9（CA19-9）含量低于对照组患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论LRFA联合静脉化疗可通过PTEN通路、Wnt通路抑制肝癌细胞生长，具有积极的临床意义。

肝癌；腹腔镜下射频消融术；静脉化疗；PTEN通路；Wnt通路

原发性肝细胞癌是恶性程度较大的肿瘤性疾病，多数患者早期症状不显著、至临床确诊时已到中晚期，只能接受保守治疗控制肿瘤细胞生长[1]。全身静脉化疗是最常见的保守治疗方法，通过化疗药物的肿瘤细胞毒性作用遏制肿瘤生长。但是全身化疗对正常组织脏器的损伤较大，且肝脏肿瘤局部的药物浓度不高，肿瘤细胞杀灭作用有限[2-3]。腹腔镜下射频消融术（laparoscopic radiofrequency ablation，LRFA）是近年兴起的全新恶性肿瘤治疗方法，较多研究证实该术式与姑息性切除术相比，并未增加患者死亡率且可以减少手术创伤[4-5]。本次研究将LRFA与静脉化疗联合应用于本院原发性肝细胞癌患者中，初步探讨联合治疗对癌细胞生长的抑制作用。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

经医院伦理委员会批准，选取2013年5月-2016年6月本院收治的肝细胞癌患者90例作为研究对象。纳入标准如下：①经临床病理学确诊；②原发性肝细胞癌；③肝细胞癌无远处转移；④患者签署知情同意书。排除标准如下：①伴全身其他组织脏器恶性肿瘤性疾病；②伴严重心脏、肾脏功能不全；③伴自身免疫性疾病；④伴造血系统功能障碍；⑤患者自愿放弃治疗或者中途退出治疗。

按照随机数表法，90例患者被分为观察组及对照组各45例。对照组中，男24例，女21例，年龄40～76岁，平均（64.38±7.11）岁，体质指数（body mass index，BMI）值21.5～26.7 kg/m2，平均（23.14±2.98）kg/m2；观察组中，男25例、女20例，年龄42～73岁，平均（64.15±7.53）岁，BMI值21.3～26.9 kg/m2，平均（23.52±2.76）kg/m2。两组患者的性别、年龄和BMI值分布差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 治疗方法

对照组患者接受常规静脉化疗，具体如下：奥沙利铂（L-OHP）85 mg/m2，静脉滴注、第15天；亚叶酸钙（LV）200 mg/m2，5-氟尿嘧啶（5-FU）前2 h静脉滴注，第15和16天； 5-FU 400 mg/m2，静脉滴注，第15和16天，5-FU 600 mg/m2，微泵注入、持续22 h，第15和16天。

观察组患者接受LRFA联合静脉化疗，具体如下：患者取平卧位，经彩色多普勒超声仪（荷兰飞利浦公司，型号IE33）定位肝脏肿瘤位置后常规消毒铺巾，局麻下在右上腹肋缘下作一弧形切口，入腹后适当游离腹腔粘连及肝脏。采用射频治疗仪（美国迈德医疗科技有限公司，型号S-1500）及射频针，沿肿瘤周围肝针缝合一圈，根据肿瘤大小步入2或3根射频针并覆盖肿瘤根部。设置射频消融参数如下：输出功率150 W、靶温度105℃，对直径＜4.0 cm的肿瘤科一次性完成治疗，对直径≥4.0 cm的肿瘤科进行多次射频治疗。消融结束后再次B超探查肿瘤是否消融完全，如存在未消融区域则再次布针对其进行消融。每次退针均在烧针道模式下退出，防止正常肝脏组织出血或者肿瘤种植转移。拔针后明确无出血、胆漏后结束手术。术后静脉化疗方案同对照组患者。

1.3 蛋白表达的检测

治疗后1周，对两组患者进行肝脏肿瘤组织活检，采用逆转录-聚合酶链反应法（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）测定PTEN信号通路基因PTEN、缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA表达量；Wnt信号通路基因β-链蛋白（β-catenin）、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、c-myc和基质金属蛋白酶7（matrix metallo proteinase-7，MMP-7）mRNA表达量。具体方法如下：按照RNA提取试剂盒（美国Sigma公司，货号T9424）说明进行肝组织标本总RNA提取，采用紫外分析、琼脂糖电泳检测总RNA浓度及完整性。根据逆转录试剂盒（美国Roche公司，货号11939823001）说明书将总RNA反转录为cDNA。PCR反应条件：95℃，30 s（1个循环）→95℃，5 s（1个循环）→60℃，31 s（40个循环）。反应结束采用软件分析PCR过程中的CT值，设置对照组患者的目标基因mRNA表达量为100，相应计算观察组患者的目标基因mRNA表达量。

1.4 血清肿瘤标志物

治疗后1周，取两组患者的空腹、外周静脉血2 ml，室温静置30 min、4℃离心（3 500 r/min）15 min，取上清液并采用放射免疫法测定其中肿瘤标志物甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、γ-谷胺酰转肽酶同工酶Ⅱ（gamma glutamyl peptidase Ⅱ，GGT-Ⅱ）、胰岛素样生长因子-2（insulin like growth factor -2，IGF-2）和糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）含量。

1.5 统计学方法

文中数据录入软件SPSS 20.0，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PTEN通路相关基因表达

治疗1周后，观察组患者的病灶组织PTEN通路相关基因PTEN mRNA表达量高于对照组患者，HIF-1和VEGF mRNA表达量低于对照组患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 Wnt通路相关基因表达

治疗1周后，观察组患者的病灶组织Wnt通路相关基因β-catenin、CyclinD1、c-myc和MMP-7 mRNA表达量均明显低于对照组患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 肿瘤标志物

治疗1周后，观察组患者的血清肿瘤标志物AFP、GGT-Ⅱ、IGF-2和CA19-9含量均明显低于对照组患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表1 治疗后肿瘤组织PTEN通路相关基因表达量比较（±s）Table 1 Comparison of expression of PTEN pathway related genes in tumor tissues after treatment （±s）

组别 PTEN HIF-1 VEGF观察组（n=45） 143.28±18.29 67.21±7.05 70.12±7.65对照组（n=45） 100.00±10.19 100.00±9.88 100.00±11.17t值 7.29 8.19 8.36P值 0.019 0.013 0.011

表2 治疗后肿瘤组织Wnt通路相关基因表达量比较（±s）Table 2 Comparison of expression of Wnt pathway related genes in tumor tissues after treatment （±s）

组别 β-catenin CyclinD1 c-myc MMP-7观察组（n=45） 67.28±7.09 59.84±6.74 65.37±7.94 71.28±7.69对照组（n=45） 100.00±9.74 100.00±10.05 100.00±9.82 100.00±11.17t值 8.29 9.17 8.62 9.02P值 0.012 0.008 0.010 0.009

表3 治疗后血清肿瘤标志物含量比较（±s）Table 3 Comparison of serum tumor markers after treatment （±s）

组别 AFP/（μg/L） GGT-Ⅱ/（pg/ml） IGF-2/（μg/L） CA19-9/（u/ml）观察组（n=45） 34.28±4.98 2.01±0.24 153.27±18.95 19.27±2.12对照组（n=45） 91.75±9.06 3.98±0.45 275.88±30.64 38.94±4.76t值 8.29 5.18 11.28 7.39P值 0.013 0.024 0.000 0.019

3 讨论

LRFA是目前中晚期恶性肿瘤性疾病的主要治疗方法之一，在结直肠肝转移患者的研究中已经发现，LRFA可降低肿瘤局部复发率，肯定了其治疗效果。LRFA是将400～500 kHz高频电流产生的离子震荡转化为热能并传导至肿瘤细胞内，一旦恶性肿瘤细胞被加热至≥50℃，将发现细胞膜溶解、蛋白质变性等一系列不可逆性改变，最终出现肿瘤细胞死亡[6]。LRFA可局部作用于肿瘤组织并使之坏死，对周围正常组织脏器的影响较小，是目前广受关注的中晚期恶性肿瘤辅助治疗手段。本次研究在传统静脉化疗基础上加入LRFA治疗，具体从肿瘤生长信号通路等方面展开研究。

较多研究均证实，PTEN信号通路在细胞增殖、凋亡中发挥重要作用，是肿瘤血管生成的调节中心[7-8]。PTEN是一种抑癌基因，较多肿瘤中存在其突变及表达减少，是肿瘤发生发展的重要因素之一。HIF-1和VEGF均是PTEN信号通路的下游基因，HIF-1在肿瘤缺氧状态下充当转录激活介质，可与VEGF启动子缺氧效应元件HRE结合共同调节VEGF表达、血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）转录，实现促肿瘤血管新生的作用[9-10]。本研究在治疗后获得肝癌病灶组织标本，经RT-PCR检测PTEN信号通路基因表达后发现：与对照组患者相比，观察组患者的肿瘤组织PTEN信号通路基因PTEN mRNA表达量较高，HIF-1和VEGF mRNA表达量较低，提示加入LRFA治疗后肝癌组织的PTEN抑癌活性被激活，同时HIF-1和VEGF等促肿瘤血管生成基因表达被遏制，整体肿瘤细胞的血供及氧供均被阻断，肿瘤细胞向凋亡发展。

Wnt信号通路在多种恶性肿瘤发生发展中均扮演重要角色，潘理会等[11]的研究明确Wnt信号通路组间蛋白的异常表达直接促使了胃癌的发生及发展；苏金玲等[12]的研究指出，Wnt信号通路间接促进了酒精性肝纤维化患者的肝星状细胞活化。在近期对肝癌细胞的研究中也发现，Wnt信号通路及其下游基因参与了肝细胞癌变的过程。β-catenin、CyclinD1、c-myc和MMP-7均是目前公认的Wnt信号通路下游分子，β-catenin处于该通路的关键部位，其降解异常及积聚可刺激Wnt信号靶基因CyclinD1、c-myc和MMP-7等转录，影响肿瘤细胞生长[13]。有研究发现β-catenin过表达可存在于82.9%左右的原发性肝细胞癌患者中，且其表达量与下游基因表达成正相关[14]。本次研究对Wnt信号通路相关基因表达进行检测发现：与对照组患者相比，观察组患者的治疗后肝癌组织中Wnt通路相关基因β-catenin、CyclinD1、c-myc和MMP-7 mRNA表达量均较低，提示LRFA可以抑制Wnt信号通路表达，这也是本手术方法发挥肿瘤杀灭作用的根本途径之一。

除了PTEN通路、Wnt通路，血清肿瘤标志物的表达情况可宏观反应临床治疗效果。AFP是最常见的肝癌肿瘤标志物，其含量与肝癌病情严重程度呈正相关。GGT-Ⅱ广泛分布于机体各脏器中，是原发性肝癌诊断的特异性标志物，其检测的特异性高达98.0%。戴卫锋[15]的研究指出，肝癌患者的血清GGT-Ⅱ明显高于非肝癌患者。IGF-2具有促细胞有丝分裂、抗凋亡等作用，可以上调周期素D1表达而促进细胞周期中G1～S期的转化。CA19-9是胃肠道肿瘤诊断标志物，可以作为肝癌诊断的辅助标志物，与AFP联合检测可以大幅提升其诊断价值。本次研究对上述4种血清肿瘤标志物含量进行检测，结果显示与对照组患者相比，观察组患者的血清AFP、GGT-Ⅱ、IGF-2和CA19-9含量均较低，宏观说明在静脉化疗基础上加入LRFA可以更为有效地遏制肿瘤活性、具有更为理想的整体治疗效果。

综上所述，LRFA联合静脉化疗可通过PTEN通路、Wnt通路抑制肝癌细胞生长，可以作为远期中晚期肝癌治疗的可靠手段。

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（吴静编辑）

In fl uence of laparoscopic radiofrequency ablation combined with intravenous chemotherapy on hepatoma cell growth mediated by PTEN and Wnt pathway

Hang-yuan Wu1, Wei Chen2, Ming-yu Wu3
(1.Department of Hepatology; 2.Department of Oncology, the Fifth People's Hospital, Wuxi, Jiangsu 214005, China; 3.Department of Hepatobiliary Surgery, Wuxi People's Hospital, Wuxi, Jiangsu 214021, China)

ObjectiveTo study the influence of laparoscopic radiofrequency ablation combined with intravenous chemotherapy on hepatoma cell growth mediated by PTEN and Wnt pathway.Methods90 cases of hepatocellular carcinoma patients from May 2013 to June 2016 were chosen as study subjects, all patients were divided into observation group (n= 45), control group (n= 45) randomly. Patients in observation group received laparoscopic radiofrequency ablation combined with intravenous chemotherapy, while those in control group received intravenous chemotherapy only. One week after treatment, two groups patients’ liver lesion tissue PTEN signaling pathway, Wnt signaling pathway related gene mRNA expression were detected by RT-PCR method; serum contents of tumor markers were tested by Radioimmunoassay.ResultsOne week after treatment, liver lesion tissue PTENmRNA expression was higher in observation group than that in control group, HIF-1, VEGF mRNA expression were lower in observation group than those in control group, the difference was statistically signi fi cant (P＜ 0.05); liver lesion tissue Wnt pathway related genes mRNA expression such as β-catenin, CyclinD1, c-myc, MMP-7 were lower in observation group than those in control group, the difference was statistically signi fi cant (P＜ 0.05); serum contents of tumor markers such as AFP, GGT-II, IGF-2, CA19-9 were lower in observation group than those in control group, the difference was statistically signi fi cant (P＜ 0.05).ConclusionLaparoscopic radiofrequency ablation combined with intravenous chemotherapy can inhibit the growth of HCC cells through the PTEN and Wnt pathway, which has positive clinical signi fi cance.

hepatocellular carcinoma; laparoscopic radiofrequency ablation; intravenous chemotherapy; PTEN pathway; Wnt pathway

R735.7

10.3969/j.issn.1007-1989.2017.04.012

1007-1989（2017）04-0067-05

2016-12-24