接种量对产气肠杆菌同步糖化暗发酵产氢的影响

张 甜， 张全国， 张志萍， 李亚猛， 路朝阳， 刘会亮

(河南农业大学 农业部可再生能源新材料与装备重点实验室， 郑州 450002)

接种量对产气肠杆菌同步糖化暗发酵产氢的影响

张 甜， 张全国， 张志萍， 李亚猛， 路朝阳， 刘会亮

(河南农业大学 农业部可再生能源新材料与装备重点实验室， 郑州 450002)

文章以小麦秸秆为原料，研究了不同接种量对产气肠杆菌同步糖化发酵产氢的影响，以期寻求最佳的接种量条件。试验以累积产氢量、产氢速率等指标来分析产气肠杆菌利用小麦秸秆进行同步糖化发酵产氢的潜力及其可行性。结果表明：在以反应液体积为200 mL，底物为5 g小麦秸秆，酶负荷为150 mg·g-1秸秆、初始pH值为6.5，温度为35℃的条件下，接种量为30%时产氢效果最好，此时的累积产气量达到737 mL,累积产氢量达到293 mL,最大产氢速率为35.42 mL·h-1L-1。该实验研究为秸秆类生物质同步糖化厌氧暗发酵产氢的进一步研究奠定了基础并提供了科学参考。

接种量； 产气肠杆菌； 同步糖化； 生物制氢

能源短缺、环境污染是当今社会面临的两大难题，因此，研究和开发可再生的洁净能源已变得迫在眉睫[1]。新能源的开发和利用已经成为人们瞩目的焦点，在新能源开发领域，生物质能的开发利用占了很大的比例，氢能因其燃烧热值高、无污染，被认为是21世纪的一种清洁能源，还被认为是最理想的化石燃料的替代能源，因此，生物制氢备受广泛关注，成为人们研究的热点。

生物制氢的研究主要集中在厌氧暗发酵制氢和光合发酵制氢[2-3]。任南琪[4-6]等对暗发酵制氢进行了研究，张全国[7-9]等对光合发酵制氢开展了大量的研究，这些研究大多采用的是先水解后产氢的两步发酵法[10-11]，利用生物质进行同步糖化制氢的报道不多[12]。同步糖化发酵工艺(Simultaneous Saccharification Fermentation Process )主要应用于酒精和乳酸工业[13],应用于生物制氢的很少。同步糖化发酵不仅可以减少反应器的数量，节约时间，降低成本，更主要的是可以解除葡萄糖和纤维二糖对纤维素酶的反馈抑制作用。而且这些研究大多基于活性污泥富集菌群的研究，纯菌种因其自身可利用的底物单一等原因，其相关研究相对较少。产气肠杆菌作为产氢主要菌属之一[14]，温度适应范围广(15℃～40℃)，能够利用葡萄糖、半乳糖、甘露醇、蔗糖、淀粉、纤维素等进行暗发酵制氢[15]。张晓蓉[16]等仅对产气肠杆菌与光合细菌协同产氢特性进行了初步研究，有关其工艺方面的具体研究相对较少。因此，本文选择了厌氧暗发酵菌群中的优势菌种之一产气肠杆菌(AS1.489)，在无菌操作台和培养箱中对其进行接种和纯培养，然后采用同步糖化发酵工艺进行产氢实验，研究了不同接种量对产气肠杆菌利用小麦秸秆进行厌氧暗发酵产氢的影响，以期寻求适合产氢的最佳接种量条件。该试验研究为秸秆类生物质同步糖化发酵制氢的进一步研究提供了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料

试验用产自郑州科教园区试验田中的小麦秸秆，自然风干后粉碎，经40目分样筛过筛后密封备用。

小麦秸秆的纤维素、半纤维素以及木质素含量的测定采用改良的王玉万法测定。测定结果如表1所示。

表1 小麦秸秆组分含量 (%)

1.1.2 菌种

试验菌种为产气肠杆菌(AS1.489)。兼性厌氧，革兰阴性杆菌，无芽孢。购于南京便诊生物科技有限公司。

利用Logistic模型对细菌生长情况进行了回归模拟，得到由细胞干重表示的细菌生长曲线如图1所示。

图1 产气肠杆菌生长曲线图

利用Logistic模型对产气肠杆菌生长情况进行回归模拟时，相关系数R2为0.9990，说明拟合效果很好。故选择培养48 h处于对数生长期后期细菌活性和浓度都较大的产气肠杆菌进行产氢实验。

1.1.3 生长培养基/产氢培养基

每1000 mL无菌水，加入15 g胰蛋白酶消化物，5 g大豆蛋白酶消化物，5 g NaCl。

1.1.4 纤维素酶

试验用纤维素酶购于上海源叶生物科技有限公司，酶活性≥1800 u·mg-1。

1.1.5 柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液

pH值为4.8柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液：

溶液A：准确称取C6H8O7·H2O 21.014 g于500 mL烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定容至1000 mL，得到0.1 mol·L-1柠檬酸溶液。

溶液B：准确称取Na3C6H5O7·2H2O 29.412 g于500 mL烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定容至1000 mL，得到0.1 mol·L-1柠檬酸钠溶液。

取A溶液230 mL，B溶液270 mL，充分混合后移入1000 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000 mL，充分混匀，4℃冰箱中冷藏保存。

1.1.6 调节pH值用试剂

5 mol·L-1的KOH溶液和36%～38%的盐酸。

1.2 试验方法

1.2.1 产氢试验

用电子天平分别准确称取5 g备用的小麦秸秆，置于洗净烘干备用的锥形瓶中，由于本试验采用的是同步糖化发酵法产氢，因此，同时向锥形瓶中各加入0.75 g纤维素酶(酶负荷150 mg·g-1)，100 mL pH值4.8的缓冲液、按容积比分别加入产氢培养基、按试验设计好的接种量梯度分别加入10%，20%，30%，40%，50%，60%处于对数生长期的菌种，然后调节反应液的初始pH值为6.5。最后，将装置置于35℃ 的恒温培养箱中进行产氢试验。试验用排水法收集气体。每个接种量梯度设置3个平行试验组，试验结果取3组试验的平均值。试验装置如图2所示：

1.气体净化器； 2.恒温培养箱； 3.反应器； 4.测样口； 5.氩气； 6.导气管； 7.气相色谱仪； 8.集气瓶； 9.贮水瓶图2 产氢实验装置图

1.2.2 pH值的测定

反应料液的pH值采用上海世诺物理光学仪器有限公司生产的PHB-1笔型酸度计测定，用蒸馏水冲洗pH计电极，然后用滤纸吸干电极上残余的溶液(也可以用待测液冲洗电极)，再将电极浸入放有待测溶液的烧杯中，并轻轻晃动电极杆，待示数稳定后记下数据即可。

1.2.3 产气量和氢气含量的测定

实验用排水法收集气体，然后用安捷伦公司生产的6820GC-14B型气相色谱仪进行氢气含量的测定。色谱条件：进样口温度100℃，柱温80℃，TCD检测器150℃，进样量500 μL,保留时间2 min。每天定时取一定量的气体进行测定，按测定值计算出氢气的浓度。

用气相色谱分析仪测定其峰面积,然后使用公式(1)计算出氢气的百分含量。

Y=0.00087×S-0.76363

(1)

式中：S为所测的峰面积。

1.2.4 生物制氢过程的回归分析

采用修正后的Gompertz方程对生物制氢过程中的产氢情况进行分析，修正后的Gompertz 方程如式(2)所示。

(2)

式中：PH2(t)为累积产氢量，mL；Pmax为最大产氢潜能，mL；rm为最大产氢速率，mL·h-1；λ为产氢延迟期，h；t为产氢反应进行的时间，h；e为自然对数底数，e=2.72。

利用非线性回归方程直接进入非线性最小二乘拟合，采用试样法使得参数平方和最小进而进行循环迭代估计参数Pmax，rm和λ，收敛标准为10-6。

2 结果与讨论

单因素试验选取底物为5 g小麦秸秆，酶负荷为150 mg·g-1秸秆，初始pH值为6.5，反应温度为35℃。为了得到产气肠杆菌发酵产氢的最适接种量条件，笔者选取接种量为10%，20%，30%，40%，50%，60%这6个梯度进行发酵产氢试验，每个接种量梯度设置3个平行试验组，试验结果取3组试验的平均值。试验用累积产氢量和产氢速率作为评价产气肠杆菌产氢潜力及其可行性的指标。

2.1 不同接种量条件下反应料液产氢过程中pH值的变化

厌氧暗发酵产氢的pH值一般在7.5～5.0之间，多为酸性条件，但是过低的pH值会使产氢细菌细胞失活，从而影响产氢效率。本试验调节反应液的初始pH值为6.5。图3为不同接种量条件下产氢过程中pH值的变化情况。

图3 不同接种量条件下产氢过程中pH值的变化

由图3可以看出：前12 h产氢料液的pH值均从初始的6.5迅速降至4.5～5.0之间。随着产氢过程的进行，接种量为10%的反应液的pH值先上下浮动，后有所下降；接种量为20%的反应液的pH值上下浮动，基本保持不变；接种量为30%，40%，50%，60%的反应液的pH值均慢慢恢复上升到起初的6.5左右，且接种量越大，pH值恢复得越快也越接近于6.5。分析其原因可能是：随着产氢过程的进行，会有小分子酸的积累，当酸的积累量大于酸的消耗量时，就会出现pH值下降的现象，接种量大的反应液的pH值后来又慢慢恢复上升，可能是由于在底物量一定的条件下，过量的菌种消耗产氢过程中积累的小分子酸用于自身生长代谢的量大于产氢过程中小分子酸的积累量，从而引起了pH值的恢复上升。由此得出：接种量小的产氢料液产氢过程中的pH值呈现出下降或上下波动的变化趋势，而接种量大的产氢料液产氢过程中的pH值呈现出先下降后缓慢恢复上升的趋势。

2.2 接种量对产气肠杆菌厌氧暗发酵产氢的影响

2.2.1 不同接种量条件下的累积产氢量

不同接种量条件下的累积产氢量如图4所示。

图4 不同接种量条件下的累积产氢量

利用修正的 Gompertz 方程对不同接种量条件下的产氢过程进行拟合，相关系数R2均在 0.99 以上，表明拟合结果较好。由图4试验结果可以看出，接种量为30%时，累积产氢量最大，累积产氢量达到293 mL，此接种量条件下，平均氢气浓度达到40%左右，最大氢气浓度达到46.9%；接种量为10%时，累积产氢量最小，20%，40%，50%，60%的累积产氢量均位于10%和30%之间，分别为215 mL，212 mL，172 mL，152 mL。由试验结果可知：接种量过大或过小都不利于产氢，因为接种量过小，底物不能被充分用于发酵产氢，从而造成了底物转化率低，产氢效率低；接种量过大，过量的菌种就会消耗产氢过程中积累的有机物用于自身的生长代谢，从而影响产氢的效率，造成产氢量的下降。

2.2.2 不同接种量条件下的产氢速率

由图5产氢速率曲线图可以看出：产氢效果最好的接种量为30%时的最大产氢速率亦最大，此时最大产氢速率为35.42 mL·h-1L-1，接种量为10%时的最大产氢速率最小，20%，40%，50%，60%的最大产氢速率位于10%和30%之间。并且由图5还可以看出：接种量越小，其最大产氢速率出现的时间越晚，即其产氢延缓时间越长；接种量越大，其最大产氢速率出现的时间越早，即其产氢延缓时间越短，分析其可能是由于菌种前期需先适应环境，并利用有机物进行生长繁殖的缘故。

图5 不同接种量条件下的产氢速率

3 结论

(1)接种量过大或过小都不利于产氢。在反应液体积为200 mL，底物为5 g小麦秸秆，酶负荷为150 mg·g-1秸秆，初始pH值为6.5，温度为35℃ 的条件下，30%为最佳接种量。此时，累积产氢量和最大产氢速率均最大，累积产气量达到737 mL,累积产氢量达到293 mL,平均氢气浓度达到40%左右，最大氢气浓度达到46.9%，最大产氢速率为35.42 mL·h-1L-1。

(2)产氢过程中，前12 h产氢料液的pH值均从初始的6.5迅速降至4.4～5.0之间，随着产氢过程的进行，接种量较小的反应液的pH值上下浮动基本保持不变或稍有所下降；接种量较大的反应液的pH值均慢慢恢复上升到起初的6.5左右，且接种量越大，pH值恢复得越快也越接近于6.5。

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The Effects of Inoculum Size on Hydrogen Production byEnterobacterAerogeneswith Simultaneous Saccharification during Dark Fermentation /

ZHANG Tian, ZHANG Quan-guo , ZHANG Zhi-ping, LI Ya-meng, LU Chao-yang , LIU Hui-liang /

( Key Laboratory of New Materials and Facilities for Rural Renewable Energy of China's Ministry of Agriculture, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

Wheat straw was taken as raw material, the effect of different inoculum size on the hydrogen production byenterobacteraerogeneswith simultaneous saccharification in dark fermentation, were studied in this paper, aiming at seeking the best inoculum size. Parameters of cumulative hydrogen production and its production rate were taken as indicators for analyzing. The results showed that, under the condition of 200 mL of reaction liquid, 5 g of wheat straw substrate, 150 mg of enzyme per gram of substrate,initial pH value of 6.5, and temperature of 35℃, the best inoculum size was 30%, from which the cumulative hydrogen production was 293 mL, the maximum hydrogen production rate reached 35.42 mL·h-1L-1.

inoculum size;enterobacteraerogenes; simultaneous saccharification; bio-hydrogen production

2016-10-14

项目来源： 国家自然科学基金项目(51376056)； 国家自然科学基金(U1504509)

张 甜(1991- )，女，硕士，主要从事可再生能源工程方面的研究工作，E-mail:1287590177@qq.com

张全国，E-mail: zquanguo@163.com

S216.4; TQ920

A

1000-1166(2017)02-0024-04