利用微电极技术研究厌氧颗粒污泥内部的微环境

李 清， 刘 芳， 张 哲， 王 慧， 杨树成

(西安交通大学 能源与动力工程学院， 西安 710049)

利用微电极技术研究厌氧颗粒污泥内部的微环境

李 清， 刘 芳， 张 哲， 王 慧， 杨树成

(西安交通大学 能源与动力工程学院， 西安 710049)

文章分别以蔗糖、乙酸和丁酸为进水唯一碳源，运行3个UASB反应器，当反应器稳定运行后，采用自制氢离子选择性液膜微电极对3种厌氧颗粒污泥进行内部pH值梯度分析，并对厌氧颗粒污泥进行了多种测试底物的产甲烷活性分析和16S rDNA测序分析。结果表明，采用微电极技术可以准确测定厌氧颗粒污泥内部的pH值梯度，并推断微生物种群的空间分布，所得结果与产甲烷活性和16S rDNA测序分析结果相一致，说明微电极技术可作为厌氧颗粒污泥内部微环境分析和微生物种群空间分布研究的有力工具。

厌氧颗粒污泥； 微电极； 微环境； 产甲烷活性

厌氧颗粒污泥实质上是多种微生物的聚集体，水解发酵菌、产氢产乙酸菌、同型产乙酸菌以及产甲烷菌组成了一个互营共生的微生态系统[1]。在厌氧颗粒污泥中，厌氧微生物生态系统不断演化的过程[2]受多种因素的影响，如废水性质、污泥负荷率、系统的选择压、pH值和温度等。不同的环境条件所培养出的污泥的微生物种群结构和空间分布不同，所以有机物降解途径不同，表现为各个厌氧颗粒污泥的微环境差异。

厌氧颗粒污泥微环境的研究对于揭示厌氧颗粒污泥形成和结构具有重要意义，基于分子生物学方法的PCR和荧光原位杂交(FISH)等技术常用于微生物群落和空间分布的分析，但这些技术难以提供微生物在聚集体中的原位活性信息。而微电极恰可以弥补不足，微电极技术是20世纪七八十年代兴起的一种分析手段[3]，其尖端可低至1 μm以下，因此具有很高的空间分辨率，是测定极小体积(微米范围)对象的微小浓度变化的特殊工具。微电极能够原位监测颗粒污泥内部底物、中间和最终产物浓度的空间变化，进而确定微生物活性和不同种群微生物的空间分布情况[4]。

笔者针对蔗糖、丁酸、乙酸为进水底物培养的厌氧颗粒污泥，基于不同有机物厌氧降解途径差异引起颗粒污泥内部pH值的变化，用实验室自制的pH值离子选择性液膜微电极对3种厌氧颗粒污泥的微结构进行研究，并对3种污泥进行16S rDNA测序分析其种群结构，同时测试污泥的产甲烷活性，以揭示颗粒污泥的形成、结构与进水组成的关系。

1 材料与方法

1.1 实验装置

实验采用3个有机玻璃制成UASB反应器，内径D为80 mm，三相分离器以下高h为520 mm，有效容积约3 L。反应器进水管管口向下，废水泵入后经反应器底部的反射作用，能较均匀的与反应区污泥相混合，避免短流和沟流现象。反应器整体置于恒温室内，将水温控制在30℃±1℃。

1.2 接种污泥及进水水质

接种污泥为咸阳市某造纸厂的IC反应器底部颗粒污泥，污泥VS/TS=70.9%，3个反应器接种相同量的污泥，反应器内污泥初始浓度为12.3 gVSS·L-1。

UASB反应器进水采用自配的合成废水，1号，2号和3号反应器(以下依次称为R1，R2和R3)分别以蔗糖、乙酸和丁酸为单一碳源，稳定运行后其浓度均为3 gCOD·L-1。R1用NaHCO3调节碱度，其浓度为3 g·L-1，R2和R3的酸均用NaOH中和，控制进水pH值不低于6.5；此外，3个反应器的进水中均投加等量的营养物质、微量元素和酵母粉[1]。

1.3 微电极测试系统

UASB稳定运行后，取污泥样品于微型模拟反应槽(见图1)，其进水水质模拟反应器条件，通过向微型槽吹氮气保持污泥的厌氧环境，用pH微电极测量污泥并采集数据。整个测试系统如图1所示。

图1 pH 微电极测量系统

1.3 分析方法

1.3.1 微电极的制作

pH微电极制备程序主要包括玻璃毛细管拉制、硅烷化、液态离子选择性膜和膜后电解液的填充[5]。制备出的pH微电极性能如下：Nernst斜率在20℃时为-57 mV·pH-1，25℃时为-59 mV·pH-1，符合Nernst方程；响应时间在60 s之内；寿命在20 d左右；线性范围为pH值4～11，可满足微生物体系pH值测量的需求。

1.3.2 测定方法

COD采用重铬酸钾回流法[6]测定；颗粒污泥VS/TS采用重量法[1]；pH值采用pH计测定；污泥的最大比产甲烷活性采用全自动甲烷潜力测试系统AMPTSⅡ(瑞典bioprocessControl公司)测定；微生物种群多样性采用宏基因组及16S rDNA测序分析。

2 实验结果与讨论

2.1 UASB反应器性能

控制UASB反应器的水力停留时间为8 h，以进水浓度为1 gCOD·L-1的条件启动反应器，根据COD去除率和VFA浓度，逐步提高进水浓度，启动20 d时进水浓度达3 gCOD·L-1，负荷提升至9 kgCOD·m-3d-1，认为启动阶段结束。后续维持该负荷持续运行反应器，其中反应器启动和稳定运行前30 d的数据如图2所示。可以看出，在启动15 d后，R1，R2，R3反应器的COD去除率一直都在90%以上，说明反应器运行良好。

图2 UASB反应器COD去除率变化

2.2 厌氧颗粒污泥的微电极分析

UASB反应器稳定运行60 d以上后，从3个反应器中取出厌氧颗粒污泥进行微电极分析。

2.2.1 R1反应器(底物蔗糖)中污泥pH微电极分析

取R1反应器中厌氧颗粒污泥，以蔗糖为底物，在微型反应槽内用pH微电极测试厌氧颗粒污泥内部不同位置pH值变化，结果如图3所示。

由图3可以看出，从颗粒污泥表层到污泥内部200 μm处时pH值逐渐降低至最低，这可能是因为在此区域发生水解酸化和产氢产乙酸过程，蔗糖转

图3 R1反应器(底物蔗糖)中颗粒污泥内部pH值梯度

化为单糖，VFA，CO2，H2后，进一步转化为乙酸和氢气。在200 μm～700 μm处pH值逐渐上升达到最大值7.5，说明在此区域发生产甲烷过程，污泥外层产生的乙酸逐步被消耗，转化为更弱的酸CO2，从而引起pH值升高。由此可以推断在成熟的厌氧颗粒污泥中，水解酸化发酵菌和产氢产乙酸菌主要存在于颗粒最外层以及中间层，对于测试污泥样品来说，200 μm处大致为是产甲烷菌的分界处，产甲烷菌在颗粒污泥核心为优势菌群。

2.2.2 R2反应器(底物乙酸)中污泥pH微电极分析

取R2反应器中厌氧颗粒污泥，分别以蔗糖、乙酸为底物，测试厌氧颗粒污泥内部不同位置pH值变化，结果分别如图4所示。

图4 R2反应器(底物乙酸)中颗粒污泥采用不同测试底物时内部pH值梯度

由图4可以看出，测试底物为乙酸时，厌氧颗粒污泥内部pH值呈逐渐上升趋势，在核心500～800 μm处，pH值基本不变，这是由于扩散进入的乙酸被产甲烷菌转化为甲烷和二氧化碳，乙酸浓度逐渐降低，到污泥核心时乙酸基本被完全降解，pH值达到最高。

由图4可以看出，当以蔗糖和丁酸为测试底物时，厌氧颗粒污泥内部pH值变化很小，说明蔗糖和丁酸在颗粒污泥内部没有发生产甲烷过程。

由上述结果可推断，乙酸废水培养的厌氧颗粒污泥微生物群落相对简单，主要为降解乙酸的产甲烷菌，降解蔗糖和丁酸的微生物相对较少。

2.2.3 R3反应器(丁酸底物)中污泥pH微电极分析

取R3反应器中厌氧颗粒污泥，分别以乙酸、丁酸为底物，用pH微电极测试厌氧颗粒污泥内部不同位置pH值变化，结果分别如图5所示。

图5 R3反应器(底物丁酸)中颗粒污泥采用不同测试底物时内部pH值梯度

当测试底物为丁酸时，与主体溶液相比，污泥表面pH值略有降低，可能与丁酸的产氢产乙酸过程有关；在污泥内部pH值逐渐升高，可能是丁酸降解产生的乙酸被产甲烷菌转化为甲烷和CO2；pH值在污泥中间位置达到稳定，说明丁酸和产生的乙酸在中间完成了降解。

当测试底物为乙酸时，曲线与测试底物为丁酸时类似，污泥内部pH值逐步上升并趋于稳定，说明乙酸被产甲烷菌利用。

当测试底物为蔗糖时，厌氧颗粒污泥内部pH值变化很小，说明蔗糖在颗粒污泥内部没有发生酸化和产甲烷过程。

由此推断，丁酸废水培养的厌氧颗粒污泥具有产氢产乙酸菌和产甲烷菌等菌群，产甲烷菌分布在污泥中间位置，但能够将蔗糖水解发酵的微生物种群含量较少。

2.3 厌氧颗粒污泥种群结构分析

2.3.1 不同测试底物条件下污泥产甲烷活性评价

对于3个不同进水的UASB反应器中的颗粒污泥，分别以蔗糖、乙酸和丁酸作为测试底物，进行污泥产甲烷活性测试，测得结果如图6～图8和表1所示。根据图6和表1结果，对于反应器R1中蔗糖为底物培养的污泥，采用蔗糖、乙酸和丁酸作为产甲烷活性测试底物，其产甲烷积累量相近，对于产甲烷菌可以直接利用的乙酸，其最大产甲烷速率和产甲烷活性均稍大；根据图7和表1结果，对于反应器R2中乙酸为底物培养的污泥，以乙酸作为测试底物时产甲烷积累量最多，产甲烷活性最大，以丁酸和蔗糖作为测试底物时，产甲烷活性急剧下降，说明该污泥中降解蔗糖和丁酸的微生物种群含量较少；根据图8和表1结果，对于反应器R3中丁酸为底物培养的污泥，测试底物乙酸和丁酸产甲烷积累量和产甲烷活性均较为接近，而测试底物为蔗糖时，产甲烷活性大幅降低，说明该污泥中降解蔗糖的微生物种群含量较少。

图6 不同测试底物条件下R1反应器(底物蔗糖)中颗粒污泥的CH4积累量

因此，虽然3个UASB反应器接种同一来源的污泥，采用不同进水驯化培养，并达到稳定后，微生物种群发生了很大变化。对于反应器R1中蔗糖培养的颗粒污泥来说，其颗粒污泥种群丰富，具备水解酸化、产氢产乙酸、产甲烷种群，底物越简单越有利于底物的降解，乙酸可以不经过水解酸化、产氢产乙酸阶段，可直接由产甲烷菌降解产甲烷，扩散为其限制条件。反应器R2中乙酸培养的成熟颗粒污泥主要是由嗜乙酸产甲烷菌组成，对非乙酸底物，降解受限。反应器R3中丁酸培养的成熟颗粒污泥主要为乙酸和丁酸降解的主要菌群，缺乏发酵细菌，因此蔗糖降解的水解酸化为其限制条件。

图7 不同测试底物条件下R2反应器(底物乙酸)中颗粒污泥的CH4积累量

图8 不同测试底物条件下R3反应器(底物丁酸)中颗粒污泥的CH4积累量

测试底物R1污泥(底物蔗糖)R2污泥(底物乙酸)R3污泥(底物丁酸)蔗糖乙酸丁酸蔗糖乙酸丁酸蔗糖乙酸丁酸产甲烷速率/(mLCH4·h-1)14.5115.6615.563.7315.031.464.1418.6919.78产甲烷活性/(gCODCH4·gVSS-1d-1)0.440.500.470.120.490.050.140.660.68

注：取5～20 h为最大活性区间计算产甲烷活性

2.3.2 16S rDNA测序分析

利用高通量测序技术对3个UASB反应器中颗粒污泥中的细菌和古菌分别进行16S rDNA测序，分析菌群多样性。图9是3种污泥中细菌在门水平上的出现概率，可以看出，优势细菌主要为绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Protecbacteria)，他们主要是水解酸化、产氢产乙酸的功能菌群[7]，根据细菌种群的丰富程度，R1(蔗糖为底物)>R3(丁酸为底物)>R2(乙酸为底物)，这说明经过驯化培养后，在较为简单的丁酸和乙酸培养环境中，难以适应的很多细菌种群逐渐被淘汰，细菌种群越来越单一。

图9 不同底物培养的厌氧颗粒污泥中细菌分布图

根据高通量测序的古菌的多样性分析结果，基于97%的相似水平，蔗糖底物、乙酸底物、丁酸底物培养的颗粒污泥中序列数分别被分为991OUTs，855OUTs，933OUTs，与底物的易被降解程度呈正相关；同时，样本覆盖率对应上上述底物依次为0.98，0.99，0.98，水平较高，说明所测序列几乎全部检出。蔗糖底物、乙酸底物、丁酸底物培养的颗粒污泥Simpson指数分别为0.42，0.63，0.33，这表示乙酸培养的颗粒污泥的古菌种群多样性水平最低，蔗糖培养的颗粒污泥的古菌种群多样性水平最高。根据图10，3个反应器的厌氧颗粒污泥，其古菌种类区别明显，反应器R1中蔗糖培养的厌氧颗粒污泥古菌菌群较为丰富；反应器R2中乙酸培养的厌氧颗粒污泥古菌菌群较为单一，主要为甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)、甲烷八叠球菌(Methanosarcina)和甲烷杆菌属(Methanobacterium)；反应器R3中丁酸培养的厌氧颗粒污泥除了甲烷鬃毛菌外，优势菌主要为甲烷杆菌属。

反应器R2中乙酸进水培养的颗粒污泥中甲烷八叠球菌(Methanosarcina)为特有的种群，与同样可以降解乙酸的甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)相比，这种产甲烷菌可以适应高浓度的乙酸，因此在乙酸进水培养的颗粒污泥中形成优势生长。反应器R3中丁酸进水培养的颗粒污泥中甲烷杆菌属(Methanobacterium)的含量远高于反应器R1和R2的颗粒污泥，该种属主要利用H2，CO2和甲酸盐[4]，这是由于长期以丁酸盐为底物驯化的结果。

以上结果表明，厌氧颗粒污泥经过不同进水底物驯化后，占优势生长的细菌和古菌为厌氧降解途径的功能菌、水解酸化菌和嗜氢嗜乙酸的产甲烷菌。

图10 不同底物培养的厌氧颗粒污泥中古菌分布图

2.4 讨论

由于厌氧消化涉及的水解酸化、产氢产乙酸、同型产乙酸和产甲烷四大微生物种群对有机物的降解会引起周围微环境中pH值的改变，可以根据厌氧颗粒污泥内部pH梯度推断不同种群微生物的空间分布，将pH微电极的测试结果与微生物种群分析的直接结果对照，可以得出更为准确的判断。

根据表1产甲烷活性测试结果和图9和图10的16S rDNA测序分析结果，反应器R1中以蔗糖为底物培养的颗粒污泥内部微生物种群最为丰富，因此图3微电极测试曲线中颗粒污泥内部pH值从表层到核心先降低(蔗糖水解酸化和VFA产氢产乙酸)，后升高(利用乙酸产甲烷)的趋势，这说明在该种污泥中，水解酸化和产氢产乙酸菌分布在污泥外层，而利用乙酸的产甲烷菌分布在污泥核心。反应器R2中以乙酸为底物培养的颗粒污泥内部微生物种群最为简单，细菌种群类别少，只能以乙酸盐为底物的甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)和甲烷八叠球菌(Methanosarcina)占古菌的近90%。由于能够降解蔗糖和丁酸的细菌数量少，所以图4中蔗糖和丁酸为测试底物时厌氧颗粒污泥内部pH值梯度很小。反应器R3中以丁酸为底物培养的颗粒污泥内部微生物种群较蔗糖污泥简单，但比乙酸污泥复杂。在该种污泥中同样能够降解蔗糖的细菌数量少，所以图5中蔗糖为测试底物时厌氧颗粒污泥内部pH值梯度很小。

因此，对照产甲烷活性和16S rDNA的分析结果可知，通过微电极对厌氧颗粒污泥内部pH值微环境的测试，可以得到其内部微生物种群的空间分布信息。

3 结论

采用微电极技术测试不同进水培养的厌氧颗粒污泥，可得到污泥内部微环境的pH值梯度，并推断微生物种群的空间分布。微电极分析得到的结果与不同测试底物产甲烷活性结果和16S rDNA测序分析结果相一致，说明微电极技术可作为厌氧颗粒污泥内部微环境分析和微生物种群空间分布研究的有力工具。

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Study on Micro-environment within Anaerobic Granular Sludge Adopting Microelectrode Method /

LI Qing， LIU Fang， ZHANG Zhe， WANG Hui， YANG Shu-cheng /

(School of Energy and Power Engineering, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710049, China)

Three UASB reactors were operated continuously with sole carbon source of sucrose, acetate and butyrate, respectively. After the reactors were operated steadily, pH gradient within the three types of anaerobic granular sludge were analyzed with self-fabricated hydrogen-ion-selective liquid-film microelectrode. Specific methanogenic activities (SMA) of granular sludges were measured under different substrates. Moreover, microbial community structures of the granular sludges were also analyzed by 16S rDNA sequencing. The results indicated that pH gradient within the anaerobic granular sludge could be measured accurately by microelectrode, through which the spatial distribution of microbial community could be deduced. The results of microelectrode analysis was consistent with the analysis results of SMA and 16s rDNA sequence, which proved that microelectrode could be a useful tool for analyzing micro-environment and microbial community spatial distribution within anaerobic granular sludge.

anaerobic granular sludge; microelectrode; micro-environment; specific methanogenic activity

2016-10-14

项目来源： 国家自然科学基金资助项目(51308453)； 中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(xjj2013078)

李 清(1991-)，女，硕士，主要从事废物厌氧生物处理方面的研究工作，E-mail：516193241@qq.com

杨树成，E-mail：yanyang@mail.xjtu.edu.cn

S216.4; X703

A

1000-1166(2017)02-0003-06