猪场废水厌氧消化液好氧处理过程酸化改进及菌群结构变化

王 伸， 邓良伟， 徐 则 ， 王 霜， 姜奕圻， 郑 丹

( 1．农业部沼气科学研究所， 成都 610041; 2．农业部农村可再生能源开发利用重点实验室， 成都 610041)

猪场废水厌氧消化液好氧处理过程酸化改进及菌群结构变化

王 伸1,2， 邓良伟1,2， 徐 则1,2， 王 霜1,2， 姜奕圻1,2， 郑 丹1,2

( 1．农业部沼气科学研究所， 成都 610041; 2．农业部农村可再生能源开发利用重点实验室， 成都 610041)

猪场废水厌氧消化液； SBR； pH值； 16SrRna； 厌氧氨氧化

1 试验材料和方法

1.1 污泥和污水

试验所用接种污泥来源于实验室培养的好氧污泥(具有硝化、反硝化活性)和厌氧氨氧化污泥。试验进水为四川邛崃某猪场废水处理沼气工程厌氧反应器出水(厌氧消化液)，以及经过固液分离但未经过厌氧处理的固液分离出水，简称原水。

1.2 试验装置

试验采用SBR工艺，实验装置为直径17 cm，高度33.8 cm的刻度塑料桶，总容积6.0 L，有效容积为5.0 L。

1.3 试验方案

1.4 检测项目及分析方法

1.5 微生物高通量测序分析

取适量污泥样品，使用E.Z.N.A Soil DNA 试剂盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)提取微生物总DNA。以16S rRNA V3～V4 区内338F (5'-ACTCCT ACGGGAGGCAGCA-3')和806R (5'-GGACTAC HVGGGTWTCTAA T-3')为特征引物，采用20 L混合反应体系，在GeneAmp 9700(ABI)型PCR 扩增仪上完成目标片段扩增。反应程序为95℃预变性2 min，95℃变性30s，55℃退火30 s, 72℃延伸30 s，25个循环后,72℃延伸5 min，每个样品重复3次。使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(Axygen,Union City,CA,U.S.)对PCR 扩增产物进行回收。基于Illumina Miseq PE300 平台，委托上海美吉生物医药科技有限公司完成对PCR 扩增产物的高通量测序，在多样性评估的基础上，采用Qiime 软件进行微生物分类学分析。

2 结果与讨论

2.1 反应器中混合液pH值变化

当反应器混合液pH值<6.5时，可以认为是酸化。3个反应器中混合液pH值变化列于图1。从图1中可以看出，试验期间只有CG组出现明显酸化现象，从第49天起pH值开始下降，直至稳定在5.8左右。两种改进策略AN组合RW组，只有AN组在第58～66天，出现短暂的酸化，其他时间都未出现酸化。在试验后期(第68天后)，pH值比较稳定，AN组、RW组出水pH值平均值分别为7.7和7.7，说明两种改进策略能明显抑制酸化。

图1 不同反应器曝气结束时混合液pH值

2.2 SBR对COD的去除

图2和图3显示了SBR对猪场废水厌氧消化液COD去除效果。从图2和图3可知，在试验前期(低68 d前)，CG组和AN组进水为厌氧消化液，其COD浓度为461 mg·L-1，COD去除率分别为7.09%和26.6%，波动较大。添加原水的RW组，进水COD为1806 mg·L-1，去除率为65.3%，随着进水COD升高，COD去除率也相应升高。在第69～91 d期间，CG组和AN组进水(厌氧消化液)COD浓度为621 mg·L-1，COD去除率分别为-13.2%和47.0%。添加原水的RW组，进水COD为3761 mg·L-1，去除率为89.4%。通过和CG组对比发现，两种酸化改进策略都能提高COD去除率，AN组和RW组分别提高了60.2%和102.6%，其中添加原水组最明显，但AN组出水COD浓度比较低。酸化后有机物的去除效果差的原因是异养细菌的最适生长pH值范围为6.5～7.5。当pH值在6.5以下时，异养细菌活性将受到抑制，在低pH值下微生物解体[18]，导致出水COD大于进水COD，COD去除率为负值。添加原水后COD去除效率提高的原因是，厌氧消化液BOD5/COD 值0.26(见表1)，不易生化降解；添加原水后 BOD5/COD由0.26提高到0.32改善了可生化性，为后处理中好氧微生物的生长提供了易降解的有机碳源[19]，关键是pH值处于稳定在7.7左右，有利于微生物生长代谢；对于AN组，同样也是因为未出现酸化，系统处于有利于异养微生物生长的pH值之间。Bortone[20]等研究发现猪粪污水好氧生化处理出水中含有大约300 mg·L-1的难降解COD，说明AN组和RW组对COD已经达到最大程度去除。

图2 进出水 COD 浓度

图3 进出水COD 去除率

2.3 SBR对氮的去除

2.3.1 氨氮浓度和氨氮转化率

表1 运行稳定时(第69～91天)进出水主要污染物浓度和污染物去除率

2.3.2 氨氮转化产物和TIN去除率

图4 进出水浓度

图5 进出水-N去除率

2.4 微生物菌群结构的变化

利用Miseq 高通量测序平台对对照组和改进组污泥中微生物多样性进行了分析。高达99.69%以上的覆盖率表明，测序结果能真实反映样品中的菌群分布情况。CG组，AN组和RW组得到相同的24523条有效序列，平均长度为分别为443，441和441 bp，其中片段长度在421～460 bp之间旳序列占总序列数的99.89%，在97%的相似水平上可聚类产生458，502和440个OTU。从稀释度曲线可看出(图5)，4组样品的曲线均趋于平坦，样品的测序数据量有效，可反映样本真实的微生物群落结构。不同反应器中样品在97%相似性上的维恩图如图8所示，显示了不同样品的OTU数目组成相似性及重叠情况。其中，有370个OTU为3组样品所共有，占各组总数的73.7%以上。不同样品的细菌群落多样性指数如表2所示。表中Chao和ACE表征菌群的丰富度，数值越大，表示样品中群落结构越丰富。Shannon和Simpson指数常用来估算样本中微生物的多样性，Shannon值越大，说明群落多样性越高，而Simpson指数值越大，说明群落多样性越低，均一性越差。表2中数据可看出，改进AN组增加了反应器中细菌群落的丰富度和多样性，同时也增加了细菌群落的均一性；而改进RW组也增加了反应器中细菌群落的丰富度和多样性，同时也增加了细菌群落的均一性，但效果不明显。对测序样品得到的序列进行比对分析，3组样品在生物分类学门的水平上进行分类，均检测到12个门，且3者门的组成类别相同，但所占比例不同，占总比例的96.1%以上。由图8可知变形菌门 (Proteobacteria) 和拟杆菌门(Bacteroidetes)为3组反应器共有的优势菌门。改进组使变形菌门 (Proteobacteria) 和拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度显著减少，而丰度有所减小。图8显示，Proteobacteria( 变形菌门) 是各污泥样品中最丰富的门，CG,AN和RW分别占37.1%，35.1%和32.4%，改进组AN和RW组丰度分别下降2.0%和4.7%。其中，变形菌门是细菌中最大的一个门，包含多种代谢种类的细菌，变形菌门细菌根据rRNA序列被分为五类，分别以希腊字母分别以希腊字母α，β，γ，δ和ε命名，β变形菌和γ变形菌以有机物为碳源，以呼吸和发酵代谢方式进行兼性异养生长，去除废水中有机物主要参与者[27-28]；δ变形菌包括严格厌氧的一些种类，同样也具有降解COD功能。另外，α-，β-和γ这3类变形菌包含了常见的氨氧化细菌(AOB)，亚硝酸氧化细菌(NOB)以及反硝化细菌种属[29]，是废水处理系统中含氮污染物去除的主要参与者。笔者实验中这3类细菌的大量出现，推测与本反应器中氮素的去除相关。CG,AN,和RW组第二主要门是拟杆菌门(Bacteroidetes)，分别占29.2%,24.5%和20.8%。拟杆菌门细菌是反应器中的另一类优势菌。拟杆菌是化能有机营养细菌，代谢碳水化合物，能够将复杂的有机物如：纤维素、淀粉等水解为单糖，再降解为乳糖、乙酸、甲酸等；将蛋白质水解为氨基酸和有机酸等；将脂类水解为低级的脂肪酸[30]。笔者研究中检测到在拟杆菌门具有一定的优势，可能在有机物的去除中发挥了作用。

图6 各反应器出水 -N 浓度变化

图7 各反应器出水 -N浓度变化

图8 各反应器出水 NOx--N 浓度变化

图9 3个反应器的TIN去除率

表2 微生物丰度和多样性情况

图10 3个样品稀释曲线图

图11 3个反应器各菌群的Venn图

图12显示的是4个样品在属的水平上主要菌群的分布情况。和CG组相比，AN组丰度下降最明显的3个组分别是Nitrosomonas，从7.95%下降到4.25%；OPB35_soil_group_norank从6.44%下降到3.19%；Ferruginibacter从2.90%下降到0.81%；增加最明显的三个组分别是：OPB56_norank从0.71%上升到3.67%；Deltaproteobacteria_unclassified从0.11%上升到3.11%；Candidate_division_WS6_norank从0.95%上升到2.84%。和CG组相比，RW组丰度下降最明显的三个组分别是Bacteroidetes_vadinHA17_norank从8.46%下降到1.16%；Nitrosomonas从7.95%下降到0.79%；BD1-7_clade从4.33%下降到1.16%；增加最明显的3个组分别是：Candidate_division_WS6_norank从0.95%上升到9.35%；OPB56_norank从0.71%上升到6.90%；Sterolibacterium从0.16%上升到2.82%；笔者就3个反应器出现最主要的几个属水平的细菌进行分析；在CG组，AN组和RW都发现好氧异养菌(如Saprospiraceae[31], Chitinophagaceae_uncultured[32]) ，和缺氧异养菌(如Bacteroidetes_vadinHA17_norank[33])和脱氮菌(如 Thermomonas[34], Comamonadaceae[35])出现富集，这些细菌以硝酸盐为电子受体来降解COD；同时也富集了属于疣微菌门(Verrucomicrobia)的OPB35_soil_group_norank, Verrucomicrobia是好氧甲烷氧化菌，有助于减少温室气体甲烷的排放[36]；在AN组和RW组中也富集了，有助于降解高分子化合物水解和酸化细菌(如Candidate_division_WS6_norank(AN =2.84%， RW=9.35%)[37-38]和Saccharibacteria_norank. (AN =2.18%， RW=5.19%[39])，但RW组富集程度高于AN组，可能原因是RW组进水含有大量的高分子化合物，更有利于水解和酸化细菌富集。

图12 3个反应器各菌群在门属水平上的相对丰度

图13 3个反应器各菌群在属水平上的相对丰度

3 结论

(2) 接种厌氧氨氧化污泥(AN组)和厌氧消化液中添加猪场废水原水(RW组)对COD去除率分别提高60.2%和102.6%，总无机氮(TIN)去除率分别为提高了11.1%和73.3%，其中RW组效果最明显。

(3) 接种厌氧氨氧化污泥(AN组)和对照(CG)组的AOB相对丰度大于NOB，出现亚硝酸积累；RW组富集的AOB相对丰度小于NOB，没出现亚硝酸积累，出水中硝酸盐以硝酸盐形式存在。

(4) 接种厌氧氨氧化污泥(AN组)富集的厌氧氨氧化细菌低于高效自养脱氮需求。

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Improvement in Acidification during Aerobic Treatment of Digested Swine Wastewater and Its Microbial Community Variation /

WANG Shen1,2， DENG Liang-wei1,2， XU Ze1,2， WANG Shuang1,2， JIANG Yi-qi1,2， ZHENG Dan1,2/

( 1.Biogas Institute of Ministry of Agriculture，Chengdu 610041，China; 2. Laboratory of Development and Application of Rural Renewable Energy，Ministry of Agriculture，Chengdu 610041，China)

Digested swine wastewater； SBR； pH； 16S rRNA； Anammox

2017-01-05

项目来源： 国家自然科学基金(31572450)； 国家生猪技术产业体系(CARS-36-10B)

王 伸(1990-)，男，安徽亳州人，在读硕士，研究方向为农村废弃物处理技术，E-mail：ws55185366@163.com

邓良伟，E-mail：dengliangwei@caas.cn

S216.4; X703

A

1000-1166(2017)02-0015-09