采用顶空固相微萃取和气质联用法分析氮源浓度对酵母香气物质合成的影响

秦伟帅，董书甲，姜凯凯,2，封文涛，刘灿珍，赵新节*

1(齐鲁工业大学，山东省微生物工程重点实验室，山东 济南，250353) 2(山东省农业科学院 农产品研究所，山东 济南，250100) 3(烟台张裕葡萄酿酒股份有限公司，山东 烟台，264000)

采用顶空固相微萃取和气质联用法分析氮源浓度对酵母香气物质合成的影响

秦伟帅1，董书甲1，姜凯凯1,2，封文涛3，刘灿珍1，赵新节1*

1(齐鲁工业大学，山东省微生物工程重点实验室，山东 济南，250353) 2(山东省农业科学院 农产品研究所，山东 济南，250100) 3(烟台张裕葡萄酿酒股份有限公司，山东 烟台，264000)

为探讨氮源浓度对酵母香气物质合成的影响，采用顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)和气质联用法(gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS)分析了不同氮源浓度的模拟葡萄汁酒精发酵后的挥发性香气成分。实验结果表明：挥发性香气成分的总量随氮源浓度的提高而增加；乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、乙酸、辛酸、己酸、2,3-丁二醇、异戊醇的含量随氮源浓度的提高而增加；异丁醇的含量随氮源浓度的提高而下降。

可同化氮;酵母;香气物质;顶空固相微萃取(HS-SPME)；气相色谱-质谱法(GC-MS)

氮源是酵母进行正常的生命活动所必需的营养元素。酿酒酵母在发酵代谢过程中优先利用简单的氮源，如铵离子和游离的α-氨基氮化合物。脯氨酸为亚氨基酸，在酵母发酵过程中难以被利用，酵母在发酵过程中也可以利用一些小分子多肽，因此，酵母菌的可同化氮(yeast assimilable nitrogen，YAN)为除脯氨酸外的游离α-氨基氮化合物、铵态氮和小分子多肽[1]。葡萄酒的香气是品种香气、发酵香气、陈酿香气的特殊混合[2]，是葡萄酒品质与风格的重要标志。葡萄酒的香气化合物包括高级醇、挥发性酸、酯类等等。酵母代谢是产生葡萄酒香气的途径之一，并与发酵基质中的氮源关系密切，因此氮源是葡萄酒中某些芳香物质的前体[3]。

目前较多的研究认为，酿酒酵母进行正常的生长代谢所需要的最低可同化氮浓度为 140～150 mg N/L，比较合适的可同化氮素含量为 200～500 mg N/L，超过500 mg N/L则认为可同化氮素含量过量[12]。HERNNDEZ-ORTE等[4]的研究表明,葡萄汁中的氨基酸与发酵后葡萄酒中的香气存在相关性，并通过向葡萄汁中添加氨基酸的方法提高了葡萄酒中挥发性香气化合物的含量，加快了酵母酒精发酵的速度，提高了葡萄酒的品质。BARBOSA等[6]的研究表明，适量提高可同化氮浓度可以提高葡萄酒中的香气物质的含量。目前关于氮源与香气成分关系的研究通常受到葡萄品种香气的影响，而以模拟葡萄汁为试材研究氮源浓度与酵母自身香气物质合成的报道相对较少。

本研究以模拟葡萄汁为试验材料，采用顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPM E)和气质联用法(gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS)分析了不同氮源浓度的模拟葡萄汁酒精发酵后的挥发性香气成分，并研究了氮源浓度与香气物质合成的联系，为探究氮源与酵母自身香气物质合成的关系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

商业酿酒酵母：EC1118，购自上海杰兔工贸有限公司。

材料：葡萄糖、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、肌醇、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、苏氨酸、磷酸氢二铵(DAP)、NaCl(分析纯)。

香气标准品：1-丙醇、异丁醇、2,3-丁二醇、苯乙醇、异戊醇、乙酸、异丁酸、辛酸、己酸、癸酸、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、己酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯，均购自美国Sigma公司；内标4-甲基-2-戊醇(色谱醇98%)购自美国Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

万分之一天平、高压蒸汽灭菌锅、显微镜、分光光度计、培养箱、超净工作台、SPME手动进样手柄、DVB/CAR/PDMS 复合萃取头(50/30μm)，美国Supelco公司；GC-7890B/MS-5977A气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司。

1.3 试验设计

本试验设计160、400、480 mg/L三种氮源浓度，以谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、苏氨酸作为有机氮源，磷酸氢二铵(DAP)作为无机氮源。

模拟葡萄汁参照张瑾等[5]的方法配制，由储液Ⅰ、储液Ⅱ和储液Ⅲ组成，成分组成如下：

储液Ⅰ:在 375 mL蒸馏水中加入 200 g葡萄糖,定容至 500 mL；

储液Ⅱ:在 250 mL蒸馏水中加入 6 g酒石酸，3 g苹果酸，0.5 g柠檬酸；

储液Ⅲ:在 250 mL蒸馏水中加入 6 mg 肌醇、可同化氮(YAN)。160、400、480 mg/L三种氮源浓度(分别以YAN160、YAN400、YAN480表示)的模拟葡萄汁中的氮源组成见表1。

表1 不同浓度氮源模拟葡萄汁的氮源组成 单位：g/L

将储液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合后用 KOH 调节pH至3.25，高压灭菌，现用现配。

将酵母活化后，按0.3 g/L的标准接种于模拟葡萄汁中，将接种后的模拟葡萄汁放于培养箱中25 ℃下培养。

1.4 分析方法

1.4.1 酵母菌计数

发酵启动后，每天进行酵母菌的稀释平板计数，每组处理做3次重复取平均值。

1.4.2 还原糖的测定

还原糖采用DNS法测定。发酵开始后每隔100 h测定1次还原含量，每组处理做3次重复取平均值。

1.4.3 发酵参数测定

发酵结束后采用蒸馏法测定发酵液的酒精度；酸碱滴定法测定总酸；DNS法测定还原糖；蒸馏法测定挥发酸[17]，每组处理做3次重复取平均值。

1.4.4 香气成分的定性与定量分析

香气物质提取：参照BARBOSA等[6]的方法进行。在20 mL顶空瓶中，加入8 mL发酵液，2g Na Cl和20 μL的2.00 g/L内标物(4-甲基-2-戊醇)，以及转子。放置于45 ℃的可加热磁力搅拌器上，预热10 min后进行萃取，萃取50 min后进样，解析10 min。

色谱条件：色谱柱为VF-WAXms(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；升温程序：40 ℃下保持2 min，然后以6 ℃/min的速度升到230 ℃，保持15 min；载气为氦气，平均线速度为25 cm/s;不分流进样。

质谱条件：电子轰击离子源；电子能量70 eV；离子源温度 230 ℃；检测器温度250 ℃；质量扫描范围m/z30～400。

定量分析：采用外标法进行定量分析。

2 结果与讨论

2.1 氮源浓度对酵母生长与发酵速率的影响

由图1可以看出，到达稳定期后酵母菌的数量随着氮源浓度的升高逐渐增大，说明高氮条件有利于酵母菌的繁殖。酵母菌到达稳定期的时间随着氮源浓度的升高逐渐增加，说明随着氮源浓度的提高酵母的对数生长期逐渐延长。

图1 发酵过程中酵母生长量的变化Fig.1 The dynamic change of yeasts during fermentation

由图2可知，当发酵800 h后，3组发酵液的酒精发酵基本结束，说明3种氮源浓度都能满足酵母酒精发酵的需要；发酵速率随着氮源浓度的升高而加快，说明高氮条件可以加快酵母的发酵速率。

图2 发酵过程中还原糖含量的变化Fig.2 The change of sugar concentration during fermentation

2.2 不同氮源浓度对发酵液理化指标的影响

由表2可以看出，3组发酵液的残糖、总酸、酒精的含量差别很小；挥发酸的含量随着氮源浓度的升高而增加。这说明发酵液的酒精度、残糖、总酸受氮源浓度的影响较小，而挥发酸的含量与氮源密切相关。

表2 不同氮源浓度发酵液的理化指标

2.3 不同氮源浓度对挥发性香气成分的影响

利用SPME-GC-MS对3种氮源浓度发酵液香气成分进行分析,共定性定量16种挥发性香气物质,包括6种酯、5种酸和5种高级醇。YAN480的发酵液中挥发性香气化合物总量为1 335.63 mg/L，在3组发酵液中挥发性香气物质的含量最多。由表3可以看出，香气物质总量随氮源浓度的提高而增加，这与JIMÉNEZ-MART等[9]的研究结果相近。

葡萄酒中由酵母合成的酯类是在酵母体内合成酶的催化下，由醇和酸形成[7]。酯类能赋予葡萄酒新鲜的水果香气，在葡萄酒的品评中发挥着重要的作用[8]。由表3可以看出，在3种氮源浓度的发酵液中，定性定量的酯类共有6种。其中3种氮源浓度的发酵液中乙酸乙酯的含量最高，占酯类化合物总量的90%以上，其次为辛酸乙酯。酯类化合物的总量随氮源浓度的提高而增加，这与缪成鹏等[10]的研究结果相似。在所测定的酯类化合物中乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯的含量随氮源浓度的提高而增加；乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯的含量随氮源浓度的提高变化不大。

在酵母的氨基酸代谢及糖酵解过程中产生的α-酮酸会经过脱羧反应生成相应的醛类，醛类再由乙醛脱氢酶氧化形成相应的酸[8]。适量的脂肪酸可以赋予葡萄酒新鲜感，但脂肪酸含量过高时则会掩盖葡萄酒的其他风味，给葡萄酒带来不好的影响[15]。乙酸是葡萄酒中的主要挥发酸,对葡萄酒的品质有着重要的影响。乙酸含量过高会使葡萄酒带有浓郁的醋酸味，降低酒的品质[12]。本研究定性定量了5种酸，这5种酸中乙酸的含量最高，癸酸的含量最低。乙酸、辛酸、己酸的含量随氮源浓度的提高而增加。HERNANDEZ-ORTE 等[11]的研究发现己酸、辛酸等中链脂肪酸随可同化氮素含量的提高而增加，BELY等[13]研究发现，可同化氮含量为200 mg/L时，乙酸含量最低，降低或增加可同化氮含量都会增加乙酸含量，这与本研究的结果相近。3组样品的异丁酸、癸酸的含量随着氮源浓度的提高变化不大。

表3 不同氮源浓度发酵液的香气物质浓度 单位：mg/L

葡萄酒中适量的高级醇有助于增强葡萄酒风味的复杂性，当总量≤300 mg/L时，对葡萄酒风味是有益的；当总量>400 mg/L，则会对葡萄酒的品质造成消极的影响[12]。葡萄醪液α-氨基态氮含量为180～195 mg/L时酵母高级醇的生成量适中[14]。本研究定性定量了5种醇类，这5种醇类中异戊醇的含量最高，其次为1-丙醇，2,3-丁二醇的含量最低。异戊醇、2,3-丁二醇的含量随氮源浓度的提高而增加；异丁醇的含量与随氮源浓度的提高而降低。GARDE-CERDN等[16]的研究表明异丁醇的含量与氮源浓度呈负相关，这与本研究的结果相似。3组样品中1-丙醇含量变化不大。

3 结论

本试验研究结果表明，随着氮源浓度的提高，酵母菌达到稳定期的时间增加，酵母菌的数量增加，发酵速率加快，挥发酸的含量增加。利用SPME-GC-MS对3种氮源浓度发酵液香气成分进行分析,共定性定量了16种挥发性香气物质,包括6种酯、5种酸和5种高级醇。香气物质总量随氮源浓度的提高而增加；乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯的含量随着氮源浓度的提高而增加；乙酸、辛酸、己酸的含量随着氮源浓度的提高而增加；2,3-丁二醇、异戊醇的含量随着氮源浓度的提高而增加；异丁醇的含量随着氮源浓度的提高而降低。

[1] UGLIANO M,HENSCHKE P A,HERDERICH M J,et al.Nitrogen management is critical for wine flavour and style[J].AustalianWine Research Institute Report,2007,22(6):24-30.

[2] CALLEJON R M, CLAVIJO A, ORTIGUEIRA P, et al. Volatile and sensory profile of organic red wines produced by different selected autochthonous and commercialSaccharomycescerevisiae, strains[J]. Analytica Chimica Acta, 2010, 660(1-2):68-75.

[3] 成冰, 张京芳, 王月晖,等. 酿酒白葡萄氨基酸组成特征分析[J]. 食品科学, 2013, 34(20):174-177.

[5] 张瑾, 王国栋, 惠竹梅. 模拟葡萄汁中添加可同化氮对酵母菌酒精发酵的影响[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2010(3):160-166.

[6] BARBOSA C, FALCO V, MENDES-FAIA A, et al. Nitrogen addition influences formation of aroma compounds, volatile acidity and ethanol in nitrogen deficient media fermented bySaccharomycescerevisiae, wine strains[J]. Journal of Bioscience & Bioengineering, 2009, 108(2):99-104.

[7] PEDDIE H A B. Ester formation in brewery fermentations[J]. Journal of the Institute of Brewing, 1990, 96(5):327-331.

[8] 郝瑞颖, 王肇悦, 刘延琳,等. 葡萄酒中酿酒酵母产生的重要香气化合物及其代谢调控[C]. 2011中国科学院研究生院微生物学研究生学术论坛,2011.

[9] JIMÉNEZ-MARTE, ARANDAA, MENDES-FERREIRA A, et al. The nature of the nitrogen source added to nitrogen depleted vinifications conducted by aSaccharomycescerevisiae, strain in synthetic must affects gene expression and the levels of several volatile compounds[J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 2007, 92(1):61-75.

[10] 缪成鹏, 张晖, 杨晓雁,等. 可同化氮含量对赤霞珠葡萄酒发酵和香气成分的影响[J]. 中国酿造, 2015, 34(1):131-136.

[11] HERNANDEZ-ORTE P, BELY M, CACHO J, et al. Impact of ammonium additions on volatile acidity, ethanol, and aromatic compound production by differentSaccharomycescerevisiaestrains during fermentation in controlled synthetic media[J]. Australian Journal of Grape & Wine Research, 2006, 12(2):150-160.

[12] 郭在力, 栾静, 孙玉梅. 可同化氮对葡萄酒发酵影响的研究进展[J]. 中国酿造, 2016, 35(4):19-23.

[13] BELY M, RINALDI A, DUBOURDIEU D. Influence of assimilable nitrogen on volatile acidity production bySaccharomycescerevisiae, during high sugar fermentation[J]. Journal of Bioscience & Bioengineering, 2003, 96(6):507-512.

[14] 程军, 秦伟帅, 赵新节. 葡萄酒酿造中高级醇的形成机制与调节[J]. 中国酿造, 2011,30(12):9-11.

[15] RIBÉREAU-GAYON P, RYCHLEWSKI C. The chemistry of wine stabilization and treatments[J]. Handbook of Enology, 2006.

[16] GARDE-CERDN T, ANCN-AZPILICUETA C. Effect of the addition of different quantities of amino acids to nitrogen-deficient must on the formation of esters, alcohols, and acids during wine alcoholic fermentation[J]. LWT-Food Science and Technology, 2008, 41(3):501-510.

[17] 刘胜. 疏果方式对葡萄与葡萄酒品质指标的影响[D]. 济南：齐鲁工业大学, 2014.

Effect of the different concentration of nitrogen sources on the formation of aroma compounds produced by yeast

QIN Wei-shuai1，DONG Shu-jia1，JIANG Kai-kai1,2，FENG Wen-tao3， LIU Can-zhen1，ZHAO Xin-jie1*

1(Shandong Key Laboratory of Microbial Engineering, Qilu University of Technology, Jinan 250353，China) 2(Institute of Agro-Food Science and Technology, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100，China) 3(Yantai ChangYu Pioneer Wine Company Limited ，Yantai 264000，China)

To explore the effect of different concentration of nitrogen sources on the formation of aroma compounds produced by yeast, the volatile aroma compounds of synthetic must from different concentration of nitrogen sources after alcoholic fermentation was determined by head space solid phase microextraction (HS-SPME) followed by the gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The results showed that the sum of aroma compound increased with the increase of nitrogen concentration. The concentration of ethyl acetate, acetic acid, 2-phenylethyl ester, dodecanoic acid, ethyl ester, acetic acid, octanoic acid, hexanoic acid, 2,3-butanediol, 1-butanol, and 3-methyl increased with the increase of nitrogen concentration. The concentration of 1-propanol, 2-methyl decreased with the increase of nitrogen concentration.

assimilation nitrogen;yeast;aroma compound;headspace solid-phase microextraction(HS-SPME)；gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703011

博士(赵新节教授为通讯作者,E-mail：719612304@qq.com)。

山东省现代农业产业技术体系果品产业创新团队(SDAIT-06-14);山东省现代农业产业技术体系专项基金(SDAIT-03-021-12)；山东省重点研发计划项目“胶东半岛产区特色葡萄酒香气质量提升关键技术研究”(2015GNC113010)

2016-08-22,改回日期：2016-11-25