6株拮抗细菌对致病疫霉抑制作用的比较

王游游，蒋继志，李颖，张亚辉，孙涵，郎亚峰

(1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2.保定学院 生化系，河北 保定 071000)



6株拮抗细菌对致病疫霉抑制作用的比较

王游游1，蒋继志1，李颖1，张亚辉1，孙涵2，郎亚峰2

(1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2.保定学院 生化系，河北 保定 071000)

比较在前期获得的明显抑制致病疫霉菌丝生长的6株细菌的抑菌性能及其防病潜力，为开发生防制剂防治马铃薯晚疫病提供依据.采用对峙培养法和打孔法测定6株细菌活体、菌液和无菌体发酵液对病菌菌丝生长的抑制作用，利用块茎切片法评价拮抗菌菌液对晚疫病的离体防治效果.结果表明，6株菌的菌液对菌丝生长的抑制作用均明显优于活体和无菌体发酵液，抑菌带宽度均在27mm以上，且均可引起菌丝体畸变，其中以WL2菌株的抑菌作用最强，活体、菌液和发酵液的抑菌带宽均在26mm以上，致畸作用也最强；此外，6株菌的菌液在离体块茎切片上的防病效果也以WL2菌液处理最好，病情指数最低(13.7)，相对保护率最高(80.5%).这表明菌株WL2比其他5个菌株在防治马铃薯晚疫病方面有更大应用潜力.

拮抗细菌；致病疫霉；抑制；离体防病

马铃薯是全球仅次于水稻、小麦和玉米的第四大粮食作物，其种植面积和产量逐年增加[1].尤其是2015年中国提出了马铃薯主粮化战略，至2020年约有50%的马铃薯将作为主粮消费[2].然而，马铃薯生产过程中常遭受许多病原菌的危害，其中由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的晚疫病是影响马铃薯生产最重要的病害[3].目前，控制晚疫病主要通过抗病品种和喷施化学农药2种方式，但因致病疫霉变异迅速，生理小种越来越复杂[4]，已经出现能克服当前生产中现有R1—R11全部抗晚疫病单基因的超级生理小种(1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11)[5].同时，致病疫霉对化学农药的抗性越来越强，加之，化学农药对食品安全和生态环境造成巨大威胁[6]，这给马铃薯晚疫病的有效防治带来了巨大的挑战.近年来，探索利用细菌[7]、放线菌[8]、真菌[9]或其代谢产物拮抗致病疫霉菌丝体生长，抑制致病疫霉孢子囊萌发及释放游动孢子等无性生殖过程，控制马铃薯晚疫病的发生，得到了许多学者的广泛关注[7]，并获得了一定成效[10].本研究室在前期研究中也筛选到了多株对致病疫霉有明显抑制作用并在离体组织实验中有突出防病效果的菌株，其中J-28[11](巨大芽孢杆菌)、Sy11[12](细黄链霉菌)等菌株对致病疫霉菌丝生长、孢子囊释放游动孢子和静止孢子萌发的抑制率达到80%以上，在离体马铃薯叶片和块茎切片上的保护率均能达到70%以上.本实验拟对前期筛选获得的对致病疫霉菌丝生长有强烈抑制作用的WL1和WL2等6株细菌的抑菌特性和离体组织防病效果进行比较，为明确其防病潜力以及开发生防制剂防治马铃薯晚疫病提供依据.

1 材料与方法

1.1 供试菌株和材料

1.2 拮抗菌活体、菌液和无菌体发酵液的制备

参考郭会婧等[13]的方法分别制备6株细菌的菌液和无菌体发酵液.

1.3 拮抗菌活体、菌液和无菌体发酵液的抑菌活性测定

采用平板对峙培养法[13]测试拮抗细菌活体对致病疫霉的抑制活性，打取经黑麦培养基(RYE)活化培养的致病疫霉菌饼(直径9mm)转接于新鲜RYE平板中央，在菌饼两侧相距30mm处分别点接一环经牛肉膏蛋白胨培养基(LB)活化后的待测拮抗菌，以点接等体积的LB培养基为对照，20 ℃暗培养8d后统计抑菌带宽度(mm).以打孔法[14]分别测定菌液和发酵液的抑菌作用，在致病疫霉菌饼两侧相距约30mm处打孔(直径9mm)，加入经LB培养的100μL菌液或发酵液，以等体积LB为对照，20 ℃暗培养8d后统计抑菌带宽度(mm).

1.4 拮抗菌菌液对致病疫霉菌丝体形态的影响

挑取对峙培养过程中受拮抗菌菌液抑制的致病疫霉菌落边缘的菌丝和对照菌落边缘的菌丝，在10×40倍显微镜视野下每次观察30个视野，记录菌丝形态变化，统计菌丝总畸变率.

菌丝总畸变率=畸变菌丝(段)数总菌丝(段)数×100%.

1.5 受拮抗菌菌液抑制后的菌丝体恢复生长能力的测定

参照冯丽娜等[15]的方法从受拮抗菌菌液强烈抑制的致病疫霉菌落边缘挑取部分菌丝体(琼脂块)转接到新鲜的RYE平板上继续培养，以挑取未受抑制的致病疫霉菌丝体为对照，20 ℃黑暗培养8d后十字交叉法测量记录菌落直径(mm)，并计算菌丝平均生长速度(mm/d).

有这样一个教学案例，说的是一位名师执教《鹬蚌相争》时，突然一位学生质疑：“鹬与蚌你一言我一语在斗嘴说话，蚌说话就要张嘴，一张嘴鹬不就脱身了吗？鹬的喙被蚌夹着，它又怎么说话？”

1.6 6株拮抗菌菌液在离体块茎上的防病效果

参照蒋继志等[14]的方法制备马铃薯块茎切片(2.0cm×2.0cm×0.5cm)，分别取50μL的6株拮抗菌菌液均匀涂抹在切片表面上，以等体积LB为对照，20 ℃黑暗保湿培养24h后，在涂抹菌液的切片表面接种致病疫霉菌饼(直径9mm)，20 ℃黑暗保湿培养7d，观察发病情况，统计病情指数及块茎保护率[16].

以上实验每处理设3～4次重复，实验重复3次.

2 结果与分析

2.1 拮抗菌活体、菌液和无菌体发酵液对致病疫霉菌丝生长的抑制作用

由图1和表1可以看出，供试6株细菌的活体对致病疫霉菌丝生长均有很强的抑制作用，均与对照达到显著差异(P<0.05)，部分菌株的抑菌效果甚至达到极显著差异(P<0.01).其中WL2菌株的抑菌作用最强，抑菌带宽度为28.3 mm，其次是WL1和M15，抑菌带宽度分别为28.1和27.2 mm，与这3株细菌对峙培养的致病疫霉菌丝几乎完全不能生长；6株细菌中WR1菌株的抑菌作用最弱，但抑菌带宽度也达到了18.9 mm.

a.活体；b.菌液；c.发酵液.图1 6株拮抗菌对致病疫霉菌丝生长的抑制作用Fig.1 Inhibition of six antagonistic strains on mycelial growth of Phytophthora infestans

经一定条件培养所得6株细菌的菌液对致病疫霉菌丝生长的抑制作用比其活体菌株更强(图1，表1)，抑菌带宽度均在27.0 mm以上，抑菌带最宽达到28.6 mm(WL2菌株)；除WL1菌株外，其余5个菌株的菌液几乎完全抑制了病菌的生长.6个菌株之间无显著差异(P<0.05)，但与对照之间均有显著差异(P<0.05).

供试6株细菌的无菌体发酵液对致病疫霉菌丝生长的抑制作用有很大差异(图1，表1).其中，WL2抑菌效果最好，抑菌带宽为26.1 mm，几乎能完全抑制致病疫霉菌丝的生长；其次是M15菌株，抑菌带宽度为22.4 mm，RYE平板上只见少许羸弱的菌丝层；而WR1和WR2的抑菌效果最弱，抑菌带宽仅分别为6.0 mm和5.2 mm，致病疫霉菌丝层占据了平板80%以上的面积.

表1 6株拮抗菌对致病疫霉菌丝生长的抑制作用

小写字母、大写字母分别表示在0.05和0.01水平上差异显著，同列不同字母表示存在显著性差异，下同.

2.2 拮抗菌菌液对致病疫霉菌体形态影响的比较

在10×40倍显微镜视野下观察发现，正常致病疫霉菌丝笔直光滑、粗细均匀、内含物分布均匀，孢子囊数量较多(20～40个/视野)，且内部充盈，并呈现典型的柠檬形(图2a).但受拮抗菌菌液抑制后，一方面菌丝体呈现不同类型的畸变：菌丝局部膨胀(图2b)、内含物分布不均匀(图2c)、菌丝直角弯曲(图2d)、粗细不均一(图2e)、菌丝分枝增多(图2f)、近分枝处内含物外泄(图2g)、菌丝顶端内含物外泄(图2h)等，另一方面孢子囊数量大幅减少(0～5个/视野，图2i)、孢子囊内含物外泄(图2j).总体上供试6株细菌菌液均能导致致病疫霉菌丝局部膨胀、分枝增多和孢子囊数量锐减.此外，不同细菌菌液对致病疫霉菌体形态的致畸类型也不尽相同(表2)，WL2菌液可造成8种致畸类型，菌丝总畸变率最高(38.7%)，与其余5株菌达到显著差异(P<0.05)，其中菌丝直角弯曲和孢子囊内含物外泄在其他几种处理中均未观察到；其次是WL1菌液，可造成6种致畸类型，菌丝总畸变率为31.2%；而WR2菌液的致畸类型最少，仅有4种，菌丝总畸变率也最低(16.6%).

a.正常菌丝；b.菌丝局部膨胀；c.菌丝内含物分布不均匀；d.菌丝直角弯曲；e.菌丝粗细不均一；f.菌丝分枝增多；g.菌丝近分枝处内含物外泄；h.菌丝顶端内含物外泄；i.孢子囊数量锐减；j.孢子囊内含物外泄.图2 6株拮抗菌菌液对致病疫霉菌体形态的影响Fig.2 Effect of six antagonistic bacterial liquid on Phytophthora infestans mycelial morphology

菌株畸变类型菌丝局部膨胀菌丝内含物分布不均匀菌丝直角弯曲菌丝粗细不均一菌丝分枝增多近分枝处内含物外泄菌丝顶端内含物外泄孢子囊数量锐减孢子囊内含物外泄菌丝畸变类型数/种菌丝总畸变率/%WL2++++++++838.7aWL1++++++631.2bM15++++++629.9bWR1+++++521.6cWK1+++++523.1bcWR2++++416.6d

2.3 拮抗菌菌液对致病疫霉菌丝的作用方式以及受抑制后菌丝恢复生长能力测定

供试6株细菌的菌液均可强烈抑制甚至完全阻止致病疫霉菌丝生长，但将受到抑制的菌丝体转接至新鲜RYE平板上后，经过一段时间的培养，菌丝均能缓慢恢复生长(图3，图4)，说明这几株拮抗菌对致病疫霉菌丝的作用方式只是抑制其生长，而非杀死菌丝.但菌丝恢复生长的速度却因拮抗细菌菌株不同而有很大差异，除WR2菌液外其余5株细菌的处理均与对照有显著差异(P<0.05).其中受WL2菌液抑制的致病疫霉菌丝恢复生长的速度最慢(2.5 mm/d)，转接至新鲜RYE平板上之后第8 d，也仅在菌饼周围有少许菌丝出现，说明WL2菌液对致病疫霉菌丝造成了极强的伤害，导致菌丝几乎不能恢复生长；其次是WL1和M15菌液，菌丝体恢复生长速度分别为4.8 mm/d和5.3 mm/d，但菌丝比较稀疏；而受WR2菌液抑制的致病疫霉菌丝恢复生长的速度最快，大约10.3 mm/d，虽然菌丝生长速度与对照(10.9 mm/d)无显著性差异(P<0.05)，但菌丝的茂盛程度显然不如对照.

图3 经6株拮抗菌菌液抑制后的菌丝恢复生长比较Fig.3 Comparison of recovery growth of Phytophthorainfestans after inhibition with six antagonistic bacterial liquid

图4 经6株拮抗菌菌液抑制后的菌丝恢复生长速度比较Fig.4 Comparison of recovery growth rate of Phytophthora infestans after inhibition with six antagonistic bacterial liquid

2.4 6株拮抗菌菌液在离体块茎上的防病效果

根据上述实验结果，对WL1和WL2等6株拮抗菌菌液在马铃薯块茎切片上的病害预防效果进行了比较(图5，表3).结果显示，经WL2菌液处理后的块茎切片防病效果最好，块茎病情指数仅为13.7，相对保护率高达80.5%，与其余菌株存在显著差异(P<0.05)，观察发现菌饼上的菌丝稀疏，未见扩散生长，块茎切片表面颜色鲜亮有光泽，未见明显变色或腐烂现象；其次WL1、M15菌液离体块茎防病效果较好，菌液处理的块茎切片病情指数分别为20.3和22.9，相对保护率分别为71.1%和67.4%，菌饼上的菌丝体主要向菌饼上方生长，并未贴在切片表面蔓延生长，块茎切片表面颜色稍有褐变，但块茎硬实没有出现腐烂现象；WR1、WR2菌液处理后的块茎防病效果最差，块茎切片病情指数分别为36.1和39.8，相对保护率分别为48.6%和43.4%，但与对照块茎切片病情指数70.3相比存在显著差异(P<0.05)，切片表面颜色深暗出现较严重褐变，菌丝沿着切片表面蔓延生长，几乎覆盖块茎表面面积的50%.对照中的切片受到病菌的侵染，切片表面颜色深暗无光泽，且菌丝厚实茂盛，沿着切片表面蔓延生长，菌丝几乎覆盖了块茎的整个表面，并且块茎已开始出现腐烂变软现象.

图5 6株拮抗菌菌液的离体块茎预防效果Fig.5 Prevention effect of six antagonistic bacterial liquid on in vitro tubers

菌株病情指数相对保护率/%WL213.780.5aWL120.371.1abM1522.967.4bWK124.065.9bWR136.148.6cWR239.843.4cCK70.30d

3 讨论

近年来，利用微生物或其代谢产物作为一种预防植物病害的手段越来越受到人们的重视和青睐[17].通过拮抗菌及其代谢产物抑制致病疫霉、控制马铃薯晚疫病的发生已受到国内外众多学者的关注[18].杨立宾等[19]比较了包括哈茨木霉T-28等6株生防木霉菌株对致病疫霉的抑制效果，结果显示，哈茨木霉T-28菌株对致病疫霉的抑制效果最好，拮抗等级为I级，该菌发酵液对菌丝生长的抑制率为64.71%，对孢子囊萌发的抑制率为64.41%，对孢子囊释放游动孢子的抑制率也达到了68.31%.Hunziker等[18]通过实验证明了产氢氰酸假单胞菌分泌的挥发性代谢产物1-Undecene可有效抑制致病疫霉菌丝生长、孢子囊形成和孢子囊直接萌发，抑制率均能达到60%以上，且发现孢子囊直接萌发与1-Undecene呈剂量依赖关系，随着1-Undecene物质浓度的增加，孢子囊直接萌发率显著下降，当1-Undecene质量浓度为0.75 mg/L时孢子囊直接萌发率约为10%左右.本实验室黄英菊等[12]对放线菌Sy11、细菌HT-6和SR13-2抑制致病疫霉菌丝生长的影响进行了比较，并在实验中观察了拮抗菌菌液对致病疫霉菌丝形态的影响，结果表明，3种拮抗菌菌液对致病疫霉菌丝生长的抑制率分别为87.8%、75.8%和71.9%；此外，拮抗菌菌液抑制菌丝生长造成的菌丝畸形因拮抗菌种类不同而有一定区别，并发现对致病疫霉拮抗效果最好的Sy11菌株对致病疫霉菌丝造成的致畸种类最多.此外，本实验室冯丽娜等[15]观察到内生真菌DC-11发酵液可导致致病疫霉菌丝局部膨大、粗细不匀、原生质外泄等多种形式的畸形，还发现受抑制的菌丝恢复生长的速度与发酵液浓度呈剂量依赖关系，当发酵液浓度达到1.91 mg/mL时可导致菌丝完全死亡.

本实验进一步比较了前期获得的6株拮抗菌抑制致病疫霉的部分性能，整体来看，各菌株活体、菌液和无菌体发酵液对菌丝生长的抑制强度并不总是完全一致，菌液抑制作用几乎普遍强于活体和发酵液的抑制作用，各菌株菌液的抑菌带宽度均能达到27 mm以上.测试菌液对致病疫霉菌体形态的影响后，发现6株拮抗菌菌液均能使菌丝产生局部膨胀、分枝增多、孢子囊数量锐减，并且不同拮抗菌对致病疫霉菌丝体形态的影响还存在一定区别，其中抑菌效果最好的WL2菌株可对致病疫霉菌丝造成8种致畸影响，菌丝总畸变率高达38.7%，这一结果与黄英菊等[12]的报道基本一致；通过考查受拮抗菌菌液抑制后菌丝的恢复生长，发现6株拮抗菌均没有使菌丝完全死亡，只是对菌丝造成不同程度的伤害，以至于抑制后的菌丝以比正常菌丝更加缓慢的速度恢复生长；其中WL2菌液抑制后的菌丝恢复生长能力最差，恢复生长速度仅为2.5 mm/d.由菌株活体、菌液和无菌体发酵液3个方面的抑菌作用、菌液对菌丝体形态的影响以及菌丝恢复生长速度等方面的比较可以看出，WL2菌株显示出了最强的抑制活性，抑菌带宽均能达到26 mm以上.此外WL2菌液在离体组织防病方面也显示出了很好的效果，经WL2菌液处理后的马铃薯块茎病情指数仅为13.7，相对保护率高达80.5%，与其余5株菌存在显著差异(P<0.05).综合以上实验结果，表明WL2菌株在防治马铃薯晚疫病方面显示出了巨大的应用潜力.今后若能进一步优化菌株培养条件，深入研究该菌抑菌机理，明确其中的抑菌物质，将有助于加快该菌株在防治马铃薯晚疫病方面的利用进程，为利用植物内生细菌防治马铃薯晚疫病增加一种选择.

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(责任编辑：赵藏赏)

Inhibition comparison of six antagonistic bacteria againstPhytophthorainfestans

WANG Youyou1,JIANG Jizhi1,LI Ying1,ZHANG Yahui1,SUN Han2,LANG Yafeng2

(1.College of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China；2.Department of Biochemistry,Baoding University,Baoding 071000,China)

The six bacterial strains including WL1,WL2,WR1,WR2,WK1 and M15,obtained in previously experiments,had the obvious inhibition toPhytophthorainfestansmycelia growth.In order to clarify the biocontrol potential,the inhibition property and the disease prevention effects oninvitrotissue of six strains were compared in this experiment.The dual-culture method and punch method were adopted to determine the inhibition of living bacteria,bacterial liquid,as well as fermented liquid onP.infestansmycelia growth.The potato tuber slices method was used to evaluate the disease prevention effect of bacterial liquid.The results showed that the inhibition effects of six bacterial liquid toP.infestansgrowth were significantly greater than that of living bacteria and fermented liquid,and the inhibitory zones were above 27 mm,and all of them caused mycelial malformation.In which,bacterial liquid of WL2 strain displayed the strongest inhibitory effect,the inhibitory zones were above 26 mm,and caused the most serious malformation.In addition,WL2 bacterial liquid acquired the best disease prevention oninvitrotissue in comparison with other 5 strains,the disease index was only 13.7,and the relative protection ratio was up to 80.5%.These results indicate that WL2 strain has more potential in control potato late blight in the future.

antagonistic bacteria；Phytophthorainfestans；inhibition；disease prevention

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.02.010

2016-09-20

河北省自然科学基金资助项目(C2015201231)；河北省科技支撑计划项目(13226502D)；河北大学研究生创新项目(X2016073)

王游游(1992—)，男，河北石家庄人，河北大学在读硕士研究生.E-mail：15032257263@163.com

蒋继志(1960—)，男，宁夏中宁人，河北大学教授，博士生导师，主要从事植物病害生物防治研究. E-mail：jizhijiang909@163.com

Q

A

1000-1565(2017)02-0169-07