天祝白牦牛MSTN基因编码区克隆及生物信息学分析

张 丽，刘丽霞，李强子，陈 红

(西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

天祝白牦牛MSTN基因编码区克隆及生物信息学分析

张 丽，刘丽霞，李强子，陈 红

(西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

为探讨天祝白牦牛MSTN基因的分子结构特征，通过PCR扩增和测序技术以及生物信息学分析工具对天祝白牦牛MSTN基因进行克隆、测序及相关生物信息学分析。结果表明，天祝白牦牛MSTN基因编码区序列全长1 128 bp，编码375个氨基酸残基；天祝白牦牛MSTN基因编码蛋白分子量42.55 ku，理论等电点为6.14；生物信息学预测发现，天祝白牦牛MSTN蛋白是不稳定的亲水蛋白，mRNA二级结构的最小自由能为-1 135.16 kJ·mol-1，蛋白质二、三级结构均是以无规卷曲和延伸链为主的混合型蛋白。天祝白牦牛MSTN基因的成功克隆为进一步研究牦牛MSTN的遗传特性和生理机制奠定了基础。

天祝白牦牛；MSTN基因；克隆；生物信息学

肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)基因是控制牛肌肉生长和瘦肉率的主效基因[1]。该基因属于转化生长因子(transforming growth factor β，TGF-β)超家族成员之一，广泛分布于动物体内。MSTN基因首先在小鼠骨骼肌cDNA文库中被克隆出来，属骨骼肌生长的负调控因子，主要通过抑制MyoD家族成员的转录活性负向调控肌细胞的生长发育，它的表达量与肌肉质量的变化呈负相关[2]。比利时蓝牛和皮尔蒙特牛的“双肌性状”是由于MSTN基因第1外显子和第3外显子上的两个碱基突变导致蛋白活性区的移码突变，不能形成成熟的MSTN蛋白，从而使脂肪不增加而体重增加[3]。目前已克隆出鱼[4]、鸡[5]、鹿[6]、马[7]、貂[8]、羊[9]、猪[10]、普通牛[11]和甘南牦牛[12]等动物的MSTN基因，但主要集中在畜禽的多态性研究上，有关天祝白牦牛MSTN基因编码蛋白的性质和结构功能的研究未见报道。

天祝白牦牛主要分布在甘肃天祝藏族自治县境内海拔2 040～4 874 m的高山、亚高山地区，为牧区人民提供肉、乳、毛等生产生活必需品，是我国乃至世界稀有而宝贵的畜禽种质资源。为深入探讨牦牛MSTN基因的性质和功能，避免人工选育和该基因演化造成的差异，本研究利用生物信息学方法从分子水平对天祝白牦牛MSTN基因序列结构及相关生物信息学特征进行预测和分析，为揭示该基因理化性质、功能信息、遗传特性、相关生理机制，及其与生长发育和肉品质性状的相关性等提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘肃省天祝县屠宰场采集白牦牛血样71份，医用采血管保存。采用传统的苯酚-氯仿抽提法进行基因组DNA提取，去离子水溶解稀释。牦牛DNA母液各取5 μL构建DNA混合池，-20 ℃冷冻保存备用。

1.2 引物设计

参考GenBank中的甘南牦牛MSTN基因序列(GenBank No. EU926670)，利用Primer6.0和SelectPrimer软件设计3对特异性引物扩增DNA混合池(表1)，引物由上海生工工程技术服务有限公司合成。

1.3 PCR扩增和克隆测序

PCR扩增体系总体积为40 μL∶DNA模板2.0 μL，0.25 μmol·L-1上下游引物各1.0 μL，2×TaqPCR MasterMix 22.0 μL，三蒸水14 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4℃保存，采用1%琼脂糖凝胶对扩增结果进行检测。

PCR产物经凝胶回收试剂盒回收纯化后在4 ℃条件下和T载体连接过夜，将重组载体导入CaCl2处理的DH5α细胞，于恒温培养箱37 ℃培养12～14 h，挑取阳性菌落于含Amp的LB液体培养基中振荡培养，结束后将克隆菌液送至北京华大基因科技股份有限公司进行测序，测序结果用DNAStar、MegAlign和Editseq软件比对和拼接获得天祝白牦牛MSTN基因编码区序列。

1.4 生物信息学分析工具

对天祝白牦牛MSTN基因编码区生物信息学分析按照参考文献[13-14]介绍的在线软件进行。

2 结果与分析

2.1 天祝白牦牛MSTN基因PCR分段扩增结果

天祝白牦牛MSTN基因PCR扩增检测结果如图1所示，扩增产物电泳条带清晰，特异性良好，片段大小与预期扩增片段相符。

2.2 天祝白牦牛MSTN基因序列测定、序列拼接和一级结构分析

克隆测序结果表明，P1、P2及P3引物扩增产物分别为575、560和593 bp，测序结果良好。利用Seqman 和MegAlign软件对三段序列手动校对、剪切、拼接获得天祝白牦牛MSTN基因序列。

表1 引物信息

Table 1 The information of primers

引物名称Primername引物序列(5’-3’)Primersequence扩增区域Amplifiedregions目的片段长度/bpProductsize/bpP15’-TGGCTTGGCGTTACTCAAAAGCA-3’Exon15755’-CTCCTCCTTACATACAAGCCAGCAGC-3’P25’-TGTTCATAGATTGATAGGAGGTGTTCG-3’Exon25605’-AATAAGCACAGGAAACTGGTAGTTATTT-3’P35’-AAGAAATGTGACATAAGCAAAATGATTAGT-3’Exon35935’-CATACTCTAGGCTTATAGCCTGTGGTA-3’

M： DNA MarkerⅢ；1～3： P1引物扩增产物；4～6： P2引物扩增产物；7～9： P3引物扩增产物M: DNA MarkerⅢ; 1-3: Amplified products of first segment; 4-6: Amplified products of second segment; 7-9: Amplified products of third segment图1 天祝白牦牛MSTN基因P1、P2及P3引物扩增产物的琼脂糖检测Fig.1 Amplifications of MSTN gene from P1, P2 and P3 primers in Tianzhu white yak

以GenBank中甘南牦牛及普通牛的MSTN基因序列为参照，结合“Kozak规则”[15]确定各外显子位置及大小。结果表明，扩增出天祝白牦牛MSTN基因3个外显子大小分别为373、374和381 bp。天祝白牦牛与甘南牦牛MSTN基因编码区序列比对发现c.417C>T的碱基突变。

利用EditSeq和GeneGuest软件对天祝白牦牛MSTN基因中编码区组成及其序列结构特征进行分析，发现天祝白牦牛MSTN基因编码区G+C含量(43.44%)低于A+T含量(56.56%)。

2.3 天祝白牦牛MSTN基因开放阅读框分析

开放阅读框(open reading frame，ORF)是DNA上的一段碱基序列，有完整的起始密码子和终止密码子序列，因而编码一个蛋白[16]。DNA序列按 6种框架阅读和翻译(每条链3种，对应3种不同的起始密码子)。ORF识别包括检测这6个阅读框架并决定哪一个包含以启动子和终止子为界限的 DNA 序列而其内部不包含启动子或密码子，符合这些条件的序列有可能对应一个真正的单一的基因产物。ORF的识别是证明一个DNA序列为特定的蛋白质编码基因的部分或全部的先决条件。本研究应用NCBI的ORF Finder程序预测得到的氨基酸产物在Pfam软件中分析比对，并参照Kozak法则[17]，获得长792 bp的ORF(图2)，起始密码子ATG位于+134，终止密码子TGA位于+1260，推测天祝白牦牛MSTN基因编码375个氨基酸残基组成的蛋白质。

2.4 天祝白牦牛MSTN编码蛋白的理化性质分析

蛋白质的基本性质包括分子质量、氨基酸组成和等电点等[18]。利用在线软件预测天祝白牦牛MSTN编码蛋白的理化性质，其氨基酸组成见表2。牦牛MSTN蛋白的原子组成是C1898H2994N506O561S21，分子质量为42.55 ku，理论等电点pI约为6.14。氨基酸残基中负电荷残基总数(Asp+Glu)为40，正电荷残基总数(Arg+Lys)为45。亮氨酸(Leu)数目最多为37个，占整个氨基酸组成的9.9%，色氨酸(Trp)和组氨酸(His)数目最少为6个。天祝白牦牛MSTN蛋白的消光系数在280 nm时为5 980，半衰期为30 h，不稳定系数为40.48。

运用Expasy服务器上的Protscale程序预测天祝白牦牛MSTN编码蛋白的亲水性/疏水性，图3表明，第14位蛋氨酸(Met)疏水性最强(最高分值2.889)；第28位谷氨酸(Glu)亲水性最强(最低分值-3.244)。按分值大小(Score<-2)划分和总平均亲水性值(-0.337)，天祝白牦牛MSTN蛋白有较强的亲水区域，是可溶性蛋白。

图2 天祝白牦牛MSTN基因的ORF分析Fig.2 ORF analysis and Pfam comparison of MSTN gene in Tianzhu white yak

表2 牦牛MSTN编码蛋白的氨基酸组成

Table 2 The amino acid composition ofMSTNgene in Tianzhu white yak

氨基酸Aminoacid数量Number频率Frequency/%Ala(A)184.8Cys(C)133.5Asp(D)154.0Glu(E)256.7Phe(F)143.7Gly(G)215.6His(H)61.6氨基酸Aminoacid数量Number频率Frequency/%Ile(I)256.7Lys(K)277.2Leu(L)379.9Met(M)82.1Asn(N)154.0Pro(P)246.4Gln(Q)174.5氨基酸Aminoacid数量Number频率Frequency/%Arg(R)184.8Ser(S)225.9Thr(T)236.1Val(V)215.6Trp(W)61.6Tyr(Y)123.2

2.5 天祝白牦牛mRNA二级结构分析

对天祝白牦牛和甘南牦牛的c.417C>T位点进行mRNA二级结构预测结果表明，SNP 位点突变致使两个牦牛亚种mRNA二级结构存在差异，并且导致mRNA二级结构自由能发生改变(图4)。甘南牦牛mRNA二级结构最小自由能为-1 124.28 kJ·mol-1，天祝白牦牛为-1 135.16 kJ·mol-1。

2.6 天祝白牦牛MSTN编码蛋白的二级与三级结构预测

正值表示疏水，负值表示亲水Positive value indicates hydrophobicity，negative value indicates hydrophilicity图3 MSTN编码蛋白的疏水性/亲水性预测Fig.3 Hydrophobic/hydrophilic analysis for Tianzhu white yak MSTN

(A)天祝白牦牛 Tianzhu white yak； (B)甘南牦牛 Gannan yak图4 牦牛RNA二级结构Fig.4 Secondary structure of RNA in yak

蛋白质二级结构主要指多肽链主链骨架依赖氢键排列成在一维方向上具有周期性结构的构象。本研究使用SOPMA软件预测牦牛MSTN编码蛋白二级结构(图4)，结果表明，165个氨基酸(总氨基酸的44.00%)和95个氨基酸(总氨基酸的25.33%)构成无规则卷曲(random coil)和延伸链(extended strand)；另外87个氨基酸(总氨基酸的23.20%)和28个氨基酸(总氨基酸的7.47%)分别形成α-螺旋(α-helix)和β-转角(β-turn)。按照Skolnick等[19]报道的蛋白质二级结构分型标准，天祝白牦牛MSTN编码蛋白二级结构可归为混合型。采用SWISS-MODEL对牦牛MSTN蛋白同源建模获得三级结构模型(图5)，该结果表明牦牛MSTN蛋白主要由无规则卷曲和延伸链构成，这与二级结构预测结果一致。

黑色代表α-螺旋；灰色代表无规则卷曲和β-转角The black represents α-helix; the grey represents random coil and β-turn图5 天祝白牦牛MSTN蛋白三级结构预测Fig.5 Putative tertiary structure of Tianzhu white yak MSTN

3 讨论

大量研究显示，MSTN基因是抑制肌肉生长的负调控因子，MSTN基因的突变是导致安格斯、海福特、弗里生、夏洛来等牛出现“双肌性状”的决定性基因[20]。如果在牦牛群体中筛选出MSTN基因突变的个体，就可以选育出产肉率高的优良种畜。因此对MSTN基因的深入研究能对天祝白牦牛的负调控肌细胞生长发育提供重要理论基础。本研究对天祝白牦牛的MSTN基因3个克隆片段进行拼接后得到了全长为1 128 bp 的编码区序列，其中第1、2、3外显子大小分别为 373、374、381 bp。天祝白牦牛和甘南牦牛MSTN基因序列比对发现，两个牦牛亚种间相差不大，仅在第2外显子处存在1个c.417C>T位点的碱基突变，属同义突变。这与杜晓华等[11]在西门塔尔牛上的研究结果完全一致。梁春年等[12]研究显示，甘南牦牛与普通牛MSTN基因存在一个c.417C>T的沉默突变。基因突变属于碱基对的改变，只涉及少数几个密码子的改变，并未改变密码子的阅读框；由于密码子具有简并性(即一个氨基酸可能对应多个密码子)，使得改变后的密码子可能仍对应原来的氨基酸，相应的蛋白质没有发生改变[21]。既然两个牦牛亚种和普通牛MSTN基因蛋白质组成相同，那么该基因在两个牦牛亚种间的基因表达调控方式也有可能相同，可以利用两个牦牛亚种间任一物种在该基因研究方面取得的成果，运用于另一物种的该基因的表达调控研究当中，来加速其研究进程[22]。

虽然MSTN基因在动物进化过程中高度保守，但也存在一定的多态性。Grobet等[23]在10个欧洲牛品种的32头“双肌牛”群体中发现了7个SNPs，其中5个SNPs造成了蛋白质结构功能的改变，1个为保守氨基酸替换，1个为沉默DNA突变；在肉牛群体中发现了9个SNPs，其中6个可导致双肌性状。冀德君等[24]在中国普通牛、大额牛、瘤牛和巴州牦牛4个群体中发现了7个SNPs，巴州牦牛在2个位点上存在区别于瘤牛和普通牛的独特碱基。可见，同一物种的不同品种间的碱基突变可能会影响蛋白质的空间结构，从而影响蛋白质功能，说明该基因具有作为遗传标记的潜在可能。

基因决定生物的性状，但最终是由蛋白质来体现的。目前大多学者对鱼[4]、鸡[5]、鹿[6]、马[7]、貂[8]、羊[9]、猪[10]、普通牛[11]和甘南牦牛[12]等动物的MSTN蛋白进行了结构功能预测。本研究预测结果表明，天祝白牦牛MSTN蛋白是由375个氨基酸折叠而成的不稳定的亲水蛋白。贾浩等[25]研究显示，蛋白质半衰期越长则稳定性越高，而本研究发现，天祝白牦牛MSTN具有较长的半衰期(30 h)却是不稳定蛋白，这与贾浩等[25]的研究报道不符，MSTN出现这一特性可能与其不同生理功能的发挥存在某种联系[26]。

蛋白质二级结构的预测和分析有助于了解氨基酸序列和三维构象之间的联系，更有助于认识蛋白的空间结构。本研究预测了天祝白牦牛MSTN蛋白二、三级结构为混合型蛋白，主要以无规则卷曲(总氨基酸的44.00%)和延伸链(总氨基酸的25.33%)为主。无规则卷曲是蛋白质肽链中构成配体/受体结合的活性部位，易受侧链相互影响而改变空间构象[27]。MSTN蛋白二级结构中大量的无规卷曲可能影响蛋白质肽链的结合活性，从而影响蛋白质的功能。

mRNA二级结构分析表明，两个牦牛亚种MSTN基因c.417C>T位点突变引起mRNA 二级结构的改变，并且导致其mRNA二级结构最小自由能由甘南牦牛的-1 124.28 kJ·mol-1变为天祝白牦牛的-1 135.16 kJ·mol-1。mRNA 二级结构和自由能的改变均会影响其结构的稳定性，进而可能会影响后续蛋白质翻译过程及其相关功能的表达。

本研究系统地对天祝白牦牛MSTN基因的理化性质和蛋白的结构功能进行了预测，在此基础上我们将进一步对MSTN基因的表达差异进行探究，以期能更好地为天祝白牦牛的肉质性状的研究提供理论基础，更好地将分子生物学技术应用于生产实践。

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(责任编辑 张 韵)

Cloning and bioinformatics analysis ofMSTNgene of Tianzhu white yak

ZHANG Li， LIU Lixia， LI Qiangzi， CHEN Hong

(CollegeofLifeScienceandEngineering，NorthwestUniversityforNationalities，Lanzhou730030，China)

In order to elucidate the structure ofMSTNgene， the completeMSTNgene sequence of Tianzhu white yak was amplified and analyzed through PCR， cloning， sequencing and the bioinformatics tools. The results showed that the sequence ofMSTNgene was 1 128 bp in length and encoded 375 amino acids with a molecular weight of 42.55 ku and pI of 6.14. Bioinformatics prediction found that MSTN protein of Tianzhu white yak is unstable hydrophilic protein and mRNA secondary structure of minimum free energy is -1 135.16 kJ·mol-1. Protein secondary and tertiary structure were based on extended strand and random coil-based mixed-type protein. The results laid a foundation for further studying on the genetic characteristics and physiological mechanisms of MSTN.

Tianzhu white yak;MSTNgene; clone; bioinformatics

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.04.15

2016-09-26

西北民族大学引进人才科研项目(xbmuyjrc201316)；西北民族大学生命科学与工程学院众创空间扶持项目；西北民族大学中央高校基本科研业务费专项资金项目(31920140077)

张丽(1980—)女，宁夏石嘴山人，博士，副教授，主要从事动物遗传育种研究。E-mail: zhangli2008@aliyun.com

S823.8+5

A

1004-1524(2017)04-0618-07

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(4): 618-624

张丽，刘丽霞，李强子，等. 天祝白牦牛MSTN基因编码区克隆及生物信息学分析[J].浙江农业学报，2017，29(4)： 618-624.