紫砂芸豆花色苷的超声／微波协同提取研究及其组成分析

李良玉宋大巍刁静静贾鹏禹张丽萍，（黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术研究中心，大庆 69）（东北林业大学林学院，哈尔滨50040）（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 69）

紫砂芸豆花色苷的超声／微波协同提取研究及其组成分析

李良玉1，2宋大巍3刁静静1贾鹏禹1张丽萍1，3
（黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术研究中心1，大庆 163319）
（东北林业大学林学院，哈尔滨2150040）
（黑龙江八一农垦大学食品学院3，大庆 163319）

以东北紫砂芸豆为原料，采用单因素试验和响应面优化试验研究超声／微波协同提取紫砂芸豆中花色苷的工艺参数，并采用液质连用色谱法对提取物进行不同浓度乙醇洗脱，进行组分分析。结果表明，超声／微波协同提取紫砂芸豆花色苷的有效工艺参数为：微波功率251 W，液料比13.7 mL／g，提取时间24.9 min。不同浓度乙醇洗脱液的色谱分析发现，提取物中主要有5种花色苷物质，其中天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷含量较高，且主要集中在40%乙醇洗脱液中。本研究为大孔树脂纯化紫砂芸豆花色苷提供了参考，为紫砂芸豆花色苷的提取加工及工业应用提供依据。

紫砂芸豆 花色苷 超声／微波协同提取 组成分析

芸豆，又名菜豆，豆科菜豆属 （Phaseolus uvlgarisL.），原产中北美洲的墨西哥，我国16世纪末开始引种栽培，并开始进行种质的改良和杂交形成我国特有的品种［1-2］。目前黑龙江省是我国出产芸豆品种数量最多的省份，主要品种有奶花芸豆、紫花芸豆、小白芸豆、深红芸豆、中白芸豆、黑芸豆和紫砂芸豆等［3］。芸豆含有凝集素、尿素酶、功能性蛋白、皂甙、花色苷等功能成分，其具有提高人体自身的免疫能力，促进新陈代谢，降低血脂等功能特性［4］。目前，对芸豆的研究主要集中在芸豆淀粉、芸豆凝集素、异黄酮、低聚糖、芸豆蛋白等制取与功能特性研究［5-8］，在芸豆花色苷的制取及其组分分析等研究还鲜有报道。因此，研究紫砂芸豆花色苷的高效提取工艺以及花色苷提取物的组成对芸豆的深度开发利用具有重要意义。

超声／微波协同提取技术研究已有先例，王传虎等［9］进行了微波-超声协同提取废弃绿豆种皮中绿色素的研究、盛玮等［10］进行了超声一微波协同提取超级黑糯玉米芯色素的工艺研究、马合木提·买买提明等［11］进行了超声-波协同萃取芜菩籽中总黄酮提取工艺的研究均取得了良好的提取效果。目前，还没有进行紫砂芸豆花色苷提取方面的研究，本文针对紫砂芸豆花色苷提取技术的研究，采用超声／微波协同提取法、色谱分离纯化技术，对实现工业化高效提取，开发紫砂芸豆的高效能够提供一定的理论基础和技术参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

紫砂芸豆：黑龙江省黑河市。

1.2 仪器与设备

Pharo300紫外可见光分光光度计：默克密理博；TGL16M高速台式离心机：YINGTAI INSTRUMENT；CW-2000型超声／微波协同提取仪：上海新拓微波溶样测试技术有限公司；RPL-ZD10装柱机：Column packing device；制备色谱系统500 mm×1.5 mm：国家杂粮工程技术研究中心；酸度计S220K：梅特勒·托利多；ME104电子天平：梅特勒·托利多；HPLC 1100 SERIES离子阱6310液质联用仪：美国Agilent。

1.3 试验方法

1.3.1 紫砂芸豆花色苷的提取

取一定量紫砂芸豆，精选除杂，粉碎过筛，得到200微米粒度的粉末状芸豆粉。采用60%的乙醇（添加0.6%的盐酸）溶液为提取剂，将芸豆粉样品浸泡在提取剂中，并置于超声／微波协同提取仪中进行不同微波功率、不同提取时间、不同料液比、不同温度下的提取，之后进行离心、过滤，最终得到紫砂芸豆花色苷粗提液［12］。

1.3.2 紫砂芸豆花色苷吸光度的测定

取提取后的紫砂芸豆乙醇提取溶液，在紫外-可见分光光度计波长范围为200～600 nm内进行扫描，测得其可见吸收光谱图，选取可见吸收光谱中的明显吸收峰进行紫砂芸豆花色苷吸光值的测定，并作为测定最佳工艺条件标准。

1.3.3 超声／微波协同提取紫砂芸豆花色苷试验

1.3.3.1 不同微波功率下提取紫砂芸豆花色苷试验

称取制备的紫砂芸豆粉10 g，按照1.3.1的提取技术路线进行提取操作。设定提取时间20 min，液料比20 mL／g，微波功率分别为100、200、300、400、500 W 5个水平，平行试验5次（n=5）。提取完成后提取液稀释10倍，测定其吸光度，进而计算出不同微波功率下紫砂芸豆花色苷的提取率。

1.3.3.2 不同液料比时提取紫砂芸豆花色苷试验

称取制备的紫砂芸豆粉10 g，按照1.3.1的提取技术路线进行提取操作。设定提取时间20 min，微波功率为200 W，液料比分别为10、15、20、25、30、35、40 mL／g，平行试验5次（n=5）。将液料比统一调配至20 mL／g后，提取液稀释10倍，测定其吸光度，进而计算出不同料液比下紫砂芸豆花色苷的提取率。

1.3.3.3 不同浸提时间提取紫砂芸豆花色苷试验

称取制备的紫砂芸豆粉10 g，按照1.3.1的提取技术路线进行提取操作。设定微波功率200 W，液料比20 mL／g，取时间分别为5、10、15、20、25 min，平行试验5次（n=5）。提取完成后提取液稀释10倍，测定其吸光度，进而计算出不同提取时间下的紫砂芸豆花色苷的提取率。

1.3.3.4 响应面法优化工艺参数

在微波功率、液料比、提取时间等单因素试验里选择每个因素中最佳的数据作为响应面法优化试验的参数，根据二次回归组合试验设计原理，以紫砂芸豆花色苷吸光度为响应值，设计微波功率、液料比、提取时间3个因素的响应面法优化试验，试验设计见表1。

表1 因素水平编码表

1.3.4 紫砂芸豆花色苷的纯化

利用响应面法优化的工艺参数进行紫砂芸豆花色苷的提取，对此提取液利用制备色谱进行提纯首先进行饱和吸附，进料流速为2.0 mL／min。饱和吸附后用去离子水进行冲洗，以去除杂质，冲洗流速2.0 mL／min，冲洗2～3倍柱体积，然后依次用40% 60%、80%乙醇洗脱剂进行梯度洗脱，分别收集洗脱剂进行测定，洗脱流速2.0 mL／min，洗脱剂（乙醇溶液）用量为2～3倍柱体积，收集洗脱液，洗脱液用旋转蒸发器进行浓缩，浓缩液用于检测花色苷的化学组成。

1.3.5 紫砂芸豆花色苷的组成初步鉴定

本研究采用液-质联用色谱的测定方法对紫砂芸豆花色苷的组成进行初步鉴定。液-质联用色谱条件如下：

液相色谱条件：色谱柱Kromasil-C18（250 mm× 4 mm，5 μm）；流动相A：2.0%甲酸溶液，流动相B 含2%甲酸的54%乙腈溶液；洗脱程序：0～1 min 10%B，1～17 min：10%～25%B；流速：1.0 mL／min进样量30 μL，柱温度30℃，检测波长525 nm。

质谱条件：电喷雾电离源，正离子模式监测，电喷雾压力35 psi，干燥气流量为10 L／min，干燥气温度325℃，m／z设置范围100～1 000［13］。

2 结果与分析

2.1 紫砂芸豆花色苷光谱特性的测定结果

图1是紫砂芸豆花色苷提取物在紫外光谱条件下的光谱特性（吸光度）测定结果。由图1可以看出紫砂芸豆乙醇提取物紫外-可见光吸收光谱中含有2个明显的吸收峰，符合黄酮类物质的吸收光谱特征。此外，紫砂芸豆乙醇提取物的紫外-可见光吸收光谱曲线在520 nm处有最大吸收峰，符合花色苷类物质在可见光范围内最大吸收峰在500～500 nm之间的特征。因此，可以初步鉴定本试验提取的紫砂芸豆乙醇提取物为花色苷类物质，选择可见光范围内最大吸收波长520 nm作为吸光度测定波长。

图1 紫砂芸豆花色苷的紫外-可见光吸收光谱曲线

2.2 超声／微波协同提取紫砂芸豆花色苷结果与分析

2.2.1 微波功率对紫砂芸豆花色苷提取率的影响

试验采用Statistical Analysis System（SAS）8.2统计软件对试验结果进行One-Way-ANOVA分析以及Duncan分析，在研究微波功率的五点三次重复的因素分析中P＜0.000 1，相关系数=0.924，说明微波功率对紫砂芸豆花色苷的提取有显著影响。由图2可知随着微波功率的增大，紫砂芸豆花色苷的吸光度呈现上升趋势。在100～300 W时，呈现上升的趋势，超过300 W后有下降趋势。因为，当微波功率在100～300 W时，微波功率不足传质能力不足。微波功率超过300 W后会引起花色苷黄酮类物质结构的变化，导致吸光度下降影响花色苷的提取。因此，本研究选择响应面优化微波功率范围为在以300 W为中心200 W到400 W之间。

图2 不同提取条件与紫砂芸豆花色苷提取的关系

2.2.2 液料比对紫砂芸豆花色苷提取的影响

试验采用SAS 8.2统计软件对试验结果进行One -Way-ANOVA分析以及Duncan分析，在研究提取液料比的七点三次重复的因素分析中P＜0.000 1，相关系数=0.951，说明提取液料比对紫砂芸豆花色苷的提取有显著影响。由图2可以看出，随着提取液料比的不断增大，紫砂芸豆花色苷的吸光度值呈现上升的趋势，这是由于少量溶剂很快溶解花色苷达到饱和，扩散推动力降低，当溶剂量足够大时，对提取基本无阻碍，OD值逐渐提高；当液料比达到20 mL／g后，吸光度趋于平衡并有下降趋势分析原因可能是随着液料比的升高，其他成分的溶出也相对增多，从而抑制了紫砂芸豆花色苷的溶出，从而影响紫砂芸豆花色苷的提取。因此，本试验选择响应面优化提取液料比范围为在以25 mL／g为中心，20 mL／g到30 mL／g之间。

2.2.3 提取时间对紫砂芸豆花色苷提取的影响

试验采用SAS 8.2统计软件对试验结果进行One-Way-ANOVA分析以及Duncan分析，在研究提取时间的五点三次重复的因素分析中P＜0.000 1，相关系数=0.967，说明提取时间对紫砂芸豆花色苷的提取有显著影响。由图2可知随着提取时间的延长，紫砂芸豆花色苷吸光度呈现上升趋势。在5～15 min时，提取率呈现快速上升的趋势，在提取15 min左右达到最大，超过20 min有下降的趋势，这可能是因为超声时间过长，导致影响了花色苷的稳定性，会使紫砂芸豆花色苷产生部分降解，破坏紫砂芸豆花色苷结构，影响其生物活性。因此，本试验选择15 min为中心点10 min到20 min之间进行响应面试验。

2.3 响应面优化试验的结果与分析

2.3.1 响应面试验结果与分析

基于单因素试验结果确定的最佳条件，以微波功率／W，液料比／mL／g，提取时间／min，这3个因素为自变量（分别以X1、X2、X3表示），以紫砂芸豆花色苷吸光度为响应值设计3因素共17个试验点的三元二次回归正交旋转组合试验，保证试验点最少前提下提高优化效率，运用SAS 8.2软件处理，试验结果见表2。

采用SAS 8.2统计软件对优化试验进行响应面回归分析（RSREG），回归方程以及回归方程各项的方差分析结果见表3，二次回归参数模型数据如表4所示。

由表3可以看出：二次回归模型的F值为10.41，模型R2为0.921 3，＜0.01，大于在0.01水平上的F值，而失拟项的F值为4.36，小于在0.05水平上的F值，说明该模型拟和结果好。一次项、二次项和交互项的F值均大于0.01水平上的F值，说明其对提取率有显著的影响。

表2 试验安排表以及试验结果

表3 回归方程各项的方差分析表

以紫砂芸豆花色苷的吸光度为响应值，得出微波功率，液料比，提取时间的编码值为自变量的三元二次回归模型为：

Y=-4．710+0．003 5X1+0．278X2+0．136X3+ 0．000 003 3X12-0．000 073 5X1X2-0．000 095X1X3-0．004 13X2-0．003 17XX-0．001 81X2

2233

2.3.2 交互作用分析

采用降维分析法研究其他两因素条件固定在零水平时，有交互作用的两因素对紫砂芸豆花色苷得率的影响。图3是SAS8.2软件绘出三维曲面及其等高线图，对这些因素中交互项之间的交互效应进行分析。

图3 Y=f（X2，X3）的响应曲面图及其等高线图

由图3可以看出，响应曲面坡度相对较大，等高线呈椭圆形，表明液料比和处理时间两者交互作用显著。由等高线可知，沿处理时间方向等高线密集而液料比方向等高线相对稀疏，说明处理时间比液料比对响应值峰值的影响大。当处理时间在20～25 min， 液料比在10～15 mL／g范围内，两者存在显著的增效作用，紫砂芸豆花色苷提取率随2个因素的增加而增加，当处理时间在25～30 min，液料比在15～20 mL／g范围内，紫砂芸豆花色苷提取率随个因素的增加而减小。

2.3.3 最优提取条件确定

为了进一步确证最佳点的值，采用SAS软件的Rsreg语句对试验模型进行响应面典型分析，以获得最大提取效果时的条件。提取率最高时的微波功率，处理时间，液料比的具体值分别为：251 W，24. min，13.7 mL／g，该条件下得到的最大的吸光度为0.32。按照最优提取条件进行试验，重复3次（n= 3）。结果紫砂芸豆花色苷的最大吸光度为0.32± 0.02，试验值与模型的理论值非常接近，可见该模型能够较好的反映出超声／微波协同提取紫砂芸豆花色苷的条件。

表4 二次回归模型参数表

2.4 紫砂芸豆花色苷的组成初步鉴定

表5、表6、表7是不同浓度乙醇洗脱液中紫砂芸豆花色苷的组成成分分析结果。

表5 40%乙醇洗脱液的液质检测分析结果

表6 60%乙醇洗脱液的液质检测分析结果

表7 80%乙醇洗脱液的液质检测分析结果

由表5、表6、表7可以看出紫砂芸豆花色苷的种类主要有5种，分别为天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷、天竺葵-3，5-二葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖-5阿拉伯糖；其中天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷含量较高，这与文献［14-16］所述基本一致。同时根据文献［14］所述天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷具有重要的生理活性，因此，应将紫砂芸豆花色苷的研究集中在天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷的纯化方面。通过研究发现紫砂芸豆花色苷的主要成分天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷主要集中在40%乙醇洗脱液中，因此，在进行大孔树脂纯化紫砂芸豆花色苷的过程中，可以先用40%的乙醇冲洗得到高纯度的天竺葵素-3-葡萄糖苷和芍药素-3-葡萄糖苷，然后再利用高浓度的乙醇冲洗去除杂质。

3 讨论

本研究以杂粮紫砂芸豆为原料进行紫砂芸豆花色苷的提取，通过超声／微波协同提取工艺的优化花色苷类物质的提取率增加10%左右，这与文献［9-11］研究结果基本一致。并通过对紫砂芸豆花色苷组成的成分，发现紫砂芸豆花色苷中花色苷组成与蓝莓花色苷相似，主要成分为天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷。因此，本研究认为可以利用紫砂芸豆代替蓝莓果进行花色苷的高效、经济生产。此外，通过液质分析发现紫砂芸豆花色苷中的天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷相对集中，主要存在于40%乙醇洗脱液中，在纯化过程中可以先用40%乙醇进行洗脱得到高纯度的紫砂芸豆花色苷，再利用高浓度的乙醇去除杂质。根据这一特征结合国家先进的模拟移动床色谱分离技术原理，可以设计模拟移动床色谱纯化紫砂芸豆花色苷的工艺参数，优化技术参数，最终实现紫砂芸豆花色苷可以实现效率、连续化的生产，实现紫砂芸豆花色苷的产业化生产。

4 结论

4.1 紫砂芸豆花色苷最佳提取工艺参数为：微波功率251 W，液料比13.7 mL／g，提取时间24.9 min，该条件下得到的最大的吸光度为0.32。按照试验优化后的提取条件试验，紫砂芸豆花色苷的最大吸光度为0.32±0.02，此条件下的试验值与预测值基本相符。可以认为本研究建立的模型能够较好的反映出超声／微波协同提取紫砂芸豆花色苷的条件。

4.2 紫砂芸豆花色苷的种类主要有5种花色苷物质，其中天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷含量较高，研究发现紫砂芸豆花色苷天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷主要集中在40%乙醇洗脱液中。

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Research on Ultrasonic／Microwave Synergistic Extraction of Anthocyanins from Purple Kidney Bean and Structure Identification

Li Liangyu1Song Dawei2Diao Jingjing1Jia Pengyu1Zhang Liping1，3
（National Coarse Cereals Engineering Research Center，Heilongjiang Bayi Agricultural University1，Daqing 163319）

（College of Forestry，Northeast Forestry University2，Haerbin 150040）
（College of Food，Heilongjiang Bayi Agricultural University3，Daqing 163319）

In this paper，purple kidney bean varieties from northeast of China was taken as the raw material，the ultrasonic／microwave synergistic extraction process of anthocyanins from purple bean were studied，and the structure was identified.As indicated in the results，the optimum ultrasonic／microwave synergistic extraction process parameters of anthocyanins from purple kidney bean were shown as following：microwave power 251 W，liquid to solid ratio 13.7 mL／g，extraction time 24.9 min.Chromatographic analysis of ethanol eluent with different concentration showed that there were mainly five kinds of anthocyanins substances，in which pelargonidin 3-glucoside，peony-3-glucoside were higher by of different concentration ethanol elution liquid quality analysis，pelargonidin3-glucoside，peony prime3-glucoside mainly concentrated in 40%ethanol eluent.The research may provide reference for anthocyanin purification with macroporous resin，and as theory base for anthocyanin process and its industrial application.

purple kidney bean，anthocyanins，ultrasonic／microwave synergistic extraction，structure identification

TS214.9

A

1003-0174（2017）03-0018-07

国家科技支撑计划（2011FU125X07）

2015-06-30

李良玉，男，1982年出生，副研究员，杂粮活性成分提纯与应用

张丽萍，女，1957年出生，教授，天然活性物质提纯与应用