苦菜地上部分总黄酮富集工艺研究

刘冬涵，王炎，田玉欣，白少娟，陈晓怡，赵怡程，周扬，何婷，折改梅

(北京中医药大学 中药学院，北京 100102)

苦菜地上部分总黄酮富集工艺研究

刘冬涵，王炎，田玉欣，白少娟，陈晓怡，赵怡程，周扬，何婷，折改梅*

(北京中医药大学 中药学院，北京 100102)

以总黄酮回收率为指标，通过静态吸附和解吸附筛选最佳树脂，确立苦菜地上部分总黄酮的富集纯化工艺。通过静态吸附与解吸附对9种不同极性的大孔树脂进行筛选，优化最佳树脂的上样pH值、上样浓度、上样流速、洗脱流速、洗脱浓度、洗脱体积和径高比等工艺参数。AB-8树脂是富集纯化苦菜地上部分总黄酮的最佳树脂，最佳工艺参数为：上样pH值为pH=5.0，上样液总黄酮质量浓度为0.672 3 mg/mL，吸附流速为2 mL/min，解吸附流速为3 mL/min，乙醇洗脱液的浓度为70%，洗脱体积为2 BV，树脂柱径高比为1∶10，大孔树脂最多重复使用3次，总黄酮纯度倍数为2.43。AB-8型大孔树脂能有效地富集纯化苦菜地上部分总黄酮。

大孔树脂；苦菜；总黄酮

苦菜(SonchusarvensisL.)为菊科(Compositae)苦苣菜属(Sonchus)植物，又名苦荬菜，苣荬菜等，是一种药食同源的草本植物[1-2]。《神农本草经》和《本草纲目》记载其清热凉血、消肿排脓、镇咳祛痰、消食和胃、利尿[3]。在中国西部和华北民间多将苦菜作为时令野菜食用，并且认为可以有效地降低血糖、血压、血脂[4-5]。据报道苦菜含有黄酮类、倍半萜内酯、奎宁酸酯、甘油酸酯类等化学成分[6-8]。课题组前期研究发现苦菜中黄酮类成分多集中于其地上部分，且地上部分具有显著的清除自由基等活性[9-11]。黄酮类化合物具有很好的降血糖，降血压，调节血脂，抗氧化，抗肿瘤等功效[12-13]，现已成为国内外研究热点。课题组依据前期研究推测苦菜黄酮类成分可能是其降血糖和抗氧化等作用的活性成分，建立了苦菜总黄酮含量的测定方法[11]，申报并授权苦菜的降血脂饮品，降血糖饮品，降血压饮品等多项发明专利[14-16]。在此研究基础上，该研究采用单因素实验对大孔树脂富集苦菜总黄酮的工艺参数进行研究，筛选最佳的工艺条件，为苦菜的降血糖，降血脂，降血压等功能成分的深度开发提供研究基础。

1 仪器，材料和试剂

TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用有限责任公司)； AL204 电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；旋转蒸发仪 RE-52A (上海亚荣生化仪器厂)；KQ-100DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

芦丁标准品(由中国食品药品检定所提供，批号：100080 - 200306)；苣荬菜(采自陕西省榆林市米脂县，经北京中医药大学中药生药系张媛副教授鉴定为苣荬菜SonchusarvensisL.)；各种树脂(沧州宝恩化工有限公司)； pH 试纸；乙醇、石油醚、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯，实验用水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 对照品和供试品溶液的制备方法

采用课题组前期建立的方法并已发表的文章[11]。

2.2 标准曲线的制作以及总黄酮含量的测定

精密量取浓度为0.246 6 mg/mL的芦丁对照品溶液2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL于25 mL容量瓶中，分别补水至5.0 mL，加入5%NaNO2溶液3.0 mL，摇匀，静置6 min。再加入10% Al(NO3)3溶液1.5 mL，摇匀，静置6 min。最后加入4%NaOH溶液8 mL，加水定容至刻度，摇匀，静置15 min，在504 nm处测定吸光度值，设空白对照。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线，得到回归方程为：A=0.954 6 C-0.008 8，r=0.999 6(n=6)，线性范围为0.217 9～0.847 3 mg/mL。

2.3 总黄酮纯度测定

精密称取一定量的总黄酮粗提物，按照2.2于波长510 nm处测定吸光度，计算总黄酮的质量分数。依法测定吸光度，测得苦菜地上部分总黄酮的质量分数为1.61%。

式中：C为溶液中总黄酮的浓度(mg/mL)；V为定容体积(mL)；M为粗提物的质量(mg)；W为总黄酮质量分数(%)。

2.4 大孔吸附树脂的预处理

大孔树脂是由有机单体和添加剂聚合而成的，本身存在有毒的有机残留物，在使用之前应进行预处理，除去残留的有毒物质[17-19]。首先称取九种型号的大孔树脂适量于锥形瓶中，用去离子水冲洗除其杂质，再用95%乙醇浸泡树脂24h，使其充分溶胀，抽滤。将九种树脂分别装柱，乙醇冲洗，即至洗出液加水不混浊(取1mL乙醇洗出液加5mL水不混浊)为止。再以4%的稀盐酸浸泡树脂2h，以去离子水洗涤为中性，最后以2%的NaOH浸泡树脂 2h，用去离子水洗涤为中性。过滤，备用。

2.5 大孔树脂型号的筛选

精密称取预处理过的九种型号的树脂各3.0g，分别置于9个150mL具塞磨口三角瓶中，精密加入苦菜供试液(含总黄酮0.672 3mg/mL)30mL，密封，浸泡12h，每隔2h充分振摇1次，按照2.2的显色方法测定吸附后各溶液中总黄酮含量，计算各种类型树脂吸附率。取上述9种吸附后的树脂，加入70%乙醇30mL，密封，浸泡12h，每隔2h充分振摇1次，测定各解吸液中总黄酮的量，计算70%乙醇解析率。

静态吸附率=( C0-C1)/C0×100%

静态解吸率=C2V2/( C0-C1)V0×100%

总黄酮回收率=静态吸附率×静态解吸率

试中：C0为供试液质量浓度， C1为吸附后溶液中总黄酮质量浓度，C2为解吸液中总黄酮质量浓度，V0为供试液体积，V2为解吸液体积。

得出的结果如表1所示。

表1 9种不同型号大孔树脂对总黄酮的静态吸附性能

由表1数据，综合比较9种极性不同的大孔树脂，其中弱极性和非极性大孔吸附树脂的吸附率和解析率均比较高，可能与苦菜中富含结构多样的黄酮和黄酮苷类的极性不同有关[9]，造成树脂对其黄酮类化合物吸附率和解析率影响因素复杂多样。单从极性考虑的这九种树脂的数据差异不是很显著，但是相较而言ADS-7树脂、AB-8树脂、HPD-300树脂三者的总黄酮吸附率比较高，其中AB-8树脂的总黄酮解吸率达到92.07%，总黄酮回收率最高。故选用AB-8树脂为富集苦菜地上部分总黄酮的最佳树脂。

2.6 AB-8型大孔树脂富集苦菜总黄酮的单因素考察

2.6.1 样品溶液pH值的考察

取5 mL黄酮质量浓度为0.672 3 mg/mL的上样溶液5份，分别调节pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，取预处理过的AB-8树脂40 g 进行湿法装柱，控制吸附流速为2 mL/min，解吸附流速为2 mL/min，以70%乙醇洗脱至无色时依次测定洗脱液中总黄酮浓度，得到不同pH值下AB-8树脂的总黄酮回收率。

图1 pH值对总黄酮回收率的影响

结果如图1所示，上样液的pH值对苦菜地上部分总黄酮的回收率显著影响较为显著。pH值<5.0时，回收率随着pH增大而增大；pH值=5.0时，回收率最大；pH值>5.0时，回收率随着pH增大而减小。苦菜黄酮类化合物的酚羟基呈酸性，可能是在改变pH值时回收率不同的主要原因。pH值为3.0、4.0时，溶液的酸性过强易于析出沉淀，同时黄酮苷类成分的苷键的容易水解，导致回收率下降；因此，试验确定最佳上样溶液pH值为5.0左右。

2.6.2 上样浓度的考察

分别配置浓度为0.336 2 mg/mL、0.490 6 mg/mL、0.672 3 mg/mL、0.832 3 mg/mL、1.008 5 mg/mL的溶液，各量取5 mL，均调节pH值为5.0进行上样，控制吸附流速为2 mL/min，解吸流速为3 mL/min，用70%乙醇洗脱，至无色，依次测定洗脱液的总黄酮浓度。

图2 上样浓度对总黄酮回收率的影响

结果见图2，在0.336 2～0.672 3 mg/mL范围内随着上样液浓度增大，总黄酮回收率呈现升高趋势。在0.672 3～1.008 5 mg/mL范围内随着上样液浓度增大，总黄酮回收率呈现降低趋势。原因可能是随着上样液浓度增加，AB-8树脂达到饱和时吸附力减弱，并且浓度过大容易堵塞树脂，因此回收率出现先增大后降低趋势。综上考虑，最佳上样浓度选择0.672 3 mg/mL。

2.6.3 吸附流速考察

取5 mL总黄酮质量浓度为0.672 3 mg/mL的样品溶液4份，调节 4 份样品溶液的pH值为5.0，分别装入预处理过的AB-8型大孔树脂柱中，控制4根树脂柱的样品溶液吸附流速分别为1 mL/min、2 mL/min、3 mL/min、4 mL/min，解吸附流速均为2 mL/min，以70%乙醇进行洗脱，计算得到不同吸附流速下的总黄酮回收率。

图3 吸附流速对总黄酮回收率的影响

结果如图3所示。由图可知，吸附流速为1～3 mL/min时回收率差异不大；吸附流速为3～4 mL/min时回收率随吸附流速的增加而急剧降低。上样液流速慢有利于树脂对于黄酮类化合物的吸附，但考虑到吸附效果和工作效率，故选择2 mL/min为最佳吸附流速。

2.6.4 解吸流速的考察

取5 mL黄酮质量浓度为0.672 3 mg/mL的样品溶液4份，调节4份样品溶液的pH值为5.0，湿法装柱，控制4根树脂柱的样品溶液吸附流速均为2 mL/min，分别控制解吸流速为1 mL/min、2 mL/min、3 mL/min、4 mL/min，以70%乙醇洗脱，至无色，测定洗脱液中的总黄酮浓度，计算得到总黄酮回收率。

图4 解吸速率对总黄酮回收率的影响

结果由图4可以看出，随着解吸流速的增加，回收率呈增加趋势，在3 mL/min时出现最大，但增加到4 mL/min时回收率呈下降趋势，故确定本工艺的最佳洗脱流速为3 mL/min。

2.6.5 洗脱液浓度的考察

取5 mL总黄酮质量浓度为0.672 3 mg/mL的样品溶液5份，调节5份样品溶液的pH值为5.0，进行湿法装柱，控制5根树脂柱的样品溶液吸附流速均为2 mL/min，控制五根树脂柱的洗脱速率均为3 mL/min，分别以浓度为10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液进行洗脱，至洗脱液无色，分别测定洗脱液中总黄酮浓度，计算其总黄酮回收率。

图5 洗脱液浓度对总黄酮回收率的影响

由图5可知，洗脱液浓度在10%～70%范围内，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮的回收率呈上升趋势，当乙醇浓度达到70%时，总黄酮的回收率达到最大值，当乙醇浓度继续增加时，总黄酮的回收率略微呈现下降的趋势。洗脱液的极性问题，是造成回收率不同的主要原因，极性多大或者过小时，大部分黄酮类成分洗脱不下来，因此出现随着乙醇浓度增加，回收率先增加后减弱。本工艺选择70%乙醇为最佳洗脱浓度。

2.6.6 洗脱体积的考察

量取5 mL总黄酮质量浓度为0.672 3 mg/mL的样品溶液5份，分别调节5份样品溶液的pH值为5.0，进行湿法装柱，控制五根树脂柱中样品的吸附流速均为2 mL/min，分别以柱体积分别为1 BV、1.5 BV、2 BV、2.5 BV、3 BV的70%乙醇溶液进行洗脱，控制洗脱流速均为3 mL/min，分别测定5份洗脱液的总黄酮浓度，计算总黄酮回收率。

图6 洗脱体积对总黄酮回收率的影响

如图6可知，在一定范围内，流出液中总黄酮回收率随着洗脱液体积的增加而增加，当洗脱体积为2 BV时，洗脱液中总黄酮回收率基本达到最大值，继续增加洗脱液体积意义不大，故选择2 BV为最佳洗脱体积。

2.6.7 树脂柱径高比的考察

取5.0 mL总黄酮质量浓度为0.672 3 mg/mL的样品溶液5份，调节5份样品溶液的pH值均为5.0，进行湿法装柱，控制五根树脂柱中样品的吸附流速为2 mL/min，均用2 BV 70%乙醇溶液以3 mL/min的流速进行洗脱，依法测定5份洗脱液中总黄酮浓度，分别计算总黄酮回收率。

图7 树脂径高比对总黄酮回收率的影响

结果如图7可知，树脂柱径高比为1∶5、1∶7、1∶10时，总黄酮回收率差别不明显。在实际应用中径高比1∶10的使用相对较多，故优选1∶10作为树脂的最佳柱径高比。

2.6.8 树脂使用次数的考察

按照上述优化的吸附条件和解吸条件，量取5 mL供试品溶液进行过柱，在同一根树脂柱上重复操作5次，分别测定5份洗脱液的总黄酮浓度，计算总黄酮回收率。

图8 树脂使用次数对总黄酮回收率的影响

结果如图8所示，树脂在使用3次之后对黄酮的吸附能力明显下降，所以可确定AB-8型大孔树脂在分离纯化苦菜地上部分总黄酮时最多使用3次。

2.6.9 总黄酮吸附泄露曲线

取供试品溶液150 mL加入已预处理好的AB-8树脂进行动态吸附。控制吸附速率为2 mL/min，每10 mL收集一次流分，以总流分体积为横坐标，各个流分中总黄酮浓度为纵坐标，绘制吸附泄露曲线。

图9 泄露曲线

结果如图9，由该曲线可见，上样体积达到70 mL时，开始出现明显泄露，此时树脂的动态吸附量为0.588 3 mg/g。

2.6.10 吸附动力学曲线

准确称取AB-8树脂3.0 g，加入样液30 mL，于具塞磨口三角瓶中，振摇吸附，每隔5 min取一次溶液测定吸光度，以时间为横坐标、总黄酮成分的吸附率纵坐标，绘制AB-8树脂对苦菜总黄酮的吸附动力学曲线。

图10 吸附动力学曲线

结果如图10所示，吸附时间达到40 min时，吸附率由增长趋势基本转为平稳，40 min后所测定的吸附率并无明显增加。由该曲线确定AB-8树脂对苦菜总黄酮的吸附达到平衡的临界时间为40 min。

2.7 最优工艺的验证

按照上述最优条件，选取3根AB-8树脂柱同时进行苦菜总黄酮富集纯化试验，实验结果测得总黄酮回收率分别为82.49%、83.07%、82.73%，平均总回收率为82.76%。且洗脱液中总黄酮的质量分数分别为3.94%、3.87%、3.92%，平均质量分数为3.91%，纯化倍数2倍。可见，AB-8型大孔树脂对苦菜地上部分总黄酮成分进行有效的富集，且重复性较好。

3 结论与讨论

本论文与已有文献比较[20]，不同之处在于对苦菜地上部分总黄酮类进行富集，增加了总黄酮回收率指标，客观的说明大孔吸附树脂纯化苦菜地上部分总黄酮方法的可行性和科学性，同时考察了九种不同极性大孔吸附树脂对总黄酮的富集优化工艺，通过静态吸附和解吸附实验确定弱极性的AB-8树脂的回收率达到78.03%，是富集纯化苦菜地上部分总黄酮的最佳树脂。该工艺优化最终选用吸附率、解析率、回收率较高且价格低且易于获得的AB-8树脂，并优化其工艺参数。最佳工艺参数：最佳上样pH值为5.0；乙醇洗脱液的浓度为70%，且洗脱体积为2BV；最佳吸附流速为2 mL/min；最佳解吸流速为3 mL/min；最佳上样液总黄酮质量浓度为0.672 3 mg/mL，树脂柱最优径高比为10∶1，树脂最多重复使用3次，纯化倍数为2.43。该工艺对苦菜地上部分的总黄酮成分进行了有效的富集，为富含苦菜黄酮类成分苦菜的降血糖、降血脂、降血压产品开发提供原料奠定基础。

[1] 孙星衍.神农本草经[M].孙冯翼,辑校.北京:商务印书馆,1955:55.

[2] 崔光志,李峰,刘杨.中药苦菜的文献考证[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(23):360-362.

[3] 金东海,东惠茹.绿色食品一野菜[M].北京:化学工业出版社,2002,1.

[4] 范民,吴玉琼.野生苦菜食品加工工艺的开发研究[J].农产品加工,2013(11):19-21.

[5] 王二霞,赵健,琚争艳,等.苦菜及其研究开发现状[J].食品工业科技,2008,29(10):272-274.

[6] 徐燕,梁敬钰.苦苣菜的化学成分[J].中国药科大学学报,2005,36(5):411-413.

[7] Nasrullah, I.Phytochemical Study from Sonchus arvensis L. Leaves for Standardizing Traditional Medicine Extract[J].planta medica,2011,77(12):1321.

[8] 夏正祥,唐中艳,梁敬钰,等.苦苣菜属植物化学成分与药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(14):300-306.

[9] 蒋雷,姚庆强,解砚英.苣荬菜化学成分的研究[J].食品与药品,2009,11(3):27-29.

[10] 武斌,张朝凤,张勉.苣荬菜全草中的三萜类成分[J].药学与临床研究,2010,18(3):276-277.

[11] 张霞,刘伟锐,姜蕊，等.不同产地、采收时间的苣荬菜地上部位总黄酮含量的考察[J].中南药学,2015(4)：417-419.

[12] 李丹,彭成,谢晓芳.黄酮类化合物治疗糖尿病及其并发症的研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(11):239.

[13] 陈秋荣.黄酮类化合物药理作用的分析[J].中国实用医药,2012,7(21):254-255.

[14] 折改梅,刘伟锐,王晓宏,等.一种降血糖功能性饮品:中国,CN 103271402 B[P].2014.07.30.

[15] 折改梅,刘伟锐,王晓宏,等.一种降血脂功能性饮:中国,CN 103251108 B[P].2014.04.30.

[16] 折改梅,刘伟锐,王晓宏,等.一种降血压功能性饮品:中国,CN 103263054 B[P].2014.07.30

[17] 刘彬果,郭文勇,钟蕾,等.大孔树脂吸附技术在中药制剂中的应用[J].解放军药学学报,2003,19(6):452-455.

[18] 黄志宏,蒋东旭,赖小平.大孔吸附树脂法富集纯化荆芥穗总黄酮的工艺研究[J].中药材,2010,33(9):1476-1480.

[19] 韩亚男,程新宇,侯俊玲.大孔树脂纯化甘草地上部分总黄酮的工艺[J].吉林中医药,2014,34(1):82-86.

[20] 安卓,贾道喜.大孔树脂分离纯化苦苣菜黄酮的工艺研究[J].食品与机械,2012,28(3):122-125.

Enriching Technic-process of Total Flavonoids from the Aerial- part of Sonchus Arvensis L.

LIU Dong-han, WANG Yan, TIAN Yu-xin, BAI Shao-juan, CHEN Xiao-yi, ZHAO Yi-cheng,ZHOU Yang, HE Ting, SHE Gai-mei

(SchoolofChinesePharmacy,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China)

Filter the best macroporous resin and establish purification technology of total flavonoids from the aerial part of Sonchus arvensis L. with the recovery index of total flavonoids as the reference. The best macroporous resin was filtered among the nine resins by investigating the static adsorption and desorption properties through experiments, and then optimize the separation process of total flavonoids from the aerial part of Sonchus arvensis L. by using the best resin. The results showed that the AB-8 macroporous resin had good adsorption and desorption. The optimal technological conditions were: pH=5.0, initial concentration 0.672 3 mg/mL, flow rate of adsorption 2 mL/min, 2BV , 70% ethanol, and desorption flow rate 3 mL/min.The diameter height ratio of resin column was 1∶10 and the macroporous resin could be used under 3 times. Under this condition, the purity of total flavonoids had been increased from 1.61% to 3.91%. The AB-8 macroporous resin could be used to purify the total flavonoids from the aerial part of Sonchus arvensis L.

Macroporous resin; Sonchus arvensis L.; Total flavonoids

2016-05-19

2016-06-20

国家级大学生创新创业项目(201510026050)

刘冬涵(1996-)，女，本科大学生，专业：中药学。

*通讯作者：折改梅(1976-),女，博士，研究员，博士生导师，研究方向：中药(民族药)药效成分和新药创制研究。

R284.2

A

1002-2392(2017)02-0094-05