归芪多糖对衰老大鼠肾组织氧化损伤作用的研究

蒲秀瑛，李海兵，李晓玥，马小龙，刘璐，任菁

(兰州理工大学 生命科学与工程学院 甘肃省中藏药筛选评价及深加工重点实验室，甘肃 兰州 730050)

归芪多糖对衰老大鼠肾组织氧化损伤作用的研究

蒲秀瑛，李海兵，李晓玥，马小龙，刘璐，任菁

(兰州理工大学 生命科学与工程学院 甘肃省中藏药筛选评价及深加工重点实验室，甘肃 兰州 730050)

目的：研究归芪多糖对D-半乳糖所致衰老大鼠肾组织氧化损伤的影响。方法：通过水提醇沉法从一定比例的当归和黄芪中提取出归芪多糖，并用苯酚-硫酸法进行多糖含量测定；除正常对照组外其余各组均采用D-半乳糖(0.15 g/kg/d)皮下注射建立大鼠衰老模型；以不同剂量的归芪多糖(2.0 g/kg和0.5 g/kg)给大鼠连续灌胃42 d后，测定其肾组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力、谷胱甘肽(GSH)含量、丙二醛(MDA)含量和蛋白质羰基含量。结果：归芪多糖可增强衰老大鼠肾组织中的SOD、GSH-PX活力和GSH含量，显著降低MDA和蛋白羰基含量。结论：归芪多糖可保护D-半乳糖所致衰老大鼠肾组织的氧化损伤，从而起到保护肾脏衰老的作用。

归芪多糖；衰老；SOD；GSH-PX；GSH；MDA；蛋白羰基

衰老(senescence, aging)，又称老化，是指生物体发育成熟后，随着年龄的增长，机体在形态、结构、功能方面出现的种种不利的渐进性退行性变化，如皮肤变薄起皱、色素形成、器官老化、智力下降等[1-2]。目前认为，由自由基引起机体衰老的主要机制有生命大分子的交联聚合和脂褐素的堆积、器官组织细胞的破坏与减少和自由基作用于免疫系统，引起细胞免疫与体液免疫功能减弱等[3]。

当归和黄芪，是我国历史悠久、临床应用广泛的中药之一，是甘肃省的道地药材，具有益气补血、增强免疫功能、抗氧化、改善肾病患者蛋白质、脂质和糖代谢紊乱等作用[4-5]。归芪多糖(GQP)是由当归和黄芪按照质量比1:5混合提取的植物多糖，前期的研究结果表明，GQP可延缓D-半乳糖所致大鼠的衰老，但对衰老大鼠肾组织氧化损伤的作用未进行研究。在此基础上，本研究通过D-半乳糖建立衰老大鼠模型，研究归芪多糖对衰老大鼠肾组织超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活力、谷胱甘肽(GSH)含量、丙二醛(MDA)含量和蛋白质羰基含量的影响，从而来判断归芪多糖是否具有保护衰老大鼠肾组织氧化损伤的作用，为归芪多糖的进一步开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药材及实验动物

当归、黄芪均购自甘肃岷县顺发药材有限公司。药材样品分别经甘肃省药品检验所鉴定为当归Angelicasinensis(Oliv)和膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch)Bge的干燥的根。

Wistar大鼠：SPF级，体质量180 g～200 g，雌雄各半，购于甘肃中医药大学实验动物中心。

1.2 试剂及仪器

超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒、还原型谷胱甘肽(GSH)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、蛋白羰基含量测定试剂盒、总蛋白浓度测定试剂盒均购于南京建成科技有限公司，D-半乳糖(sigma公司)，维生素E(厦门星鲨制药有限公司，批号:091110)。

ES-2002H电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)，高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，HH-4恒温水浴锅(北京科委永兴仪器有限公司)，N4S紫外可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)。

1.3 归芪多糖的制备及含量测定

1.3.1 水提醇沉法提取归芪多糖粗品

将当归与黄芪的混合物(1∶5)以10倍量(体积质量比)80%的乙醇回流提取2次，每次2 h；过滤得归芪粗粉。然后将归芪残渣加入圆底烧瓶中，加蒸馏水1∶10料液比，80 ℃蒸馏水超声、回流2次，每次2 h。水提取物加3倍乙醇4 ℃沉淀12 h；沉淀物蒸馏水溶解，离心，得上清液，减压浓缩，得归芪多糖粗品[6]。

1.3.2 Sevag法除蛋白

将归芪多糖粗品用少量蒸馏水溶解，将氯仿按多糖水溶液1/5体积加入，然后加氯仿体积1/5的正丁醇，剧烈振摇20 min离心，分去水层与溶液层交界处的变性蛋白，重复3～5次；收集上层多糖溶液，减压浓缩得归芪多糖[7]。

1.3.3 归芪多糖中多糖含量的测定

应用苯酚-硫酸法测定归芪多糖的多糖含量[8]。

1.4 归芪多糖对肾组织氧化损伤作用的影响

1.4.1 实验动物分组

取50只大鼠，随机分为5组，每组10只，雌雄各半，分别为正常对照组、衰老模型对照组、阳性药物对照组(维生素E混悬液0.1 g/kg)、归芪多糖高剂量组、归芪多糖低剂量组[9]。

1.4.2 衰老大鼠模型的建立及灌胃给药

除正常对照组外，其余各组大鼠按0.15 g/(kg·d)皮下注射D-半乳糖，正常对照组注射同剂量的生理盐水。从第8天开始，同时对归芪多糖高、低剂量组进行灌胃，配置100 mg/mL的归芪多糖水溶液，高剂量组按2 g/(kg·d)、低剂量组按0.5 g/(kg·d)灌胃。同时配置维生素E混悬液(0.1 g/kg)作为阳性对照组，每只每天灌服，1次/天，共计42 d[10-11]。

1.4.3 肾组织氧化损伤指标的检测

42 d后，处死大鼠，取出部分肾组织用预冷的生理盐水漂洗，拭干，加入9倍体积的冷生理盐水，玻璃匀浆器充分研磨，3 000 r/min离心5 min，收集上清得10%的肾组织匀浆液。采用相应的试剂盒测定肾组织SOD、GSH-PX活力，GSH、MDA和蛋白羰基含量[12]。

1.5 统计学分析

2 结果与分析

2.1 归芪多糖得率及多糖含量的测定

归芪多糖得率为8.79%，苯酚-硫酸法测得其多糖含量为87.6%。

2.2 归芪多糖对衰老大鼠肾组织MDA、蛋白羰基含量的影响

从表1可以看出，衰老模型组与正常对照组相比，MDA含量显著升高(P<0.05)，说明D-半乳糖可加速大鼠衰老，自由基引发肾组织脂质过氧化，不饱和脂肪酸破坏，使MDA产量增多；经过高、低剂量归芪多糖(2、0.5 g/kg)以及维生素E(100 mg/kg)的干预后，各组大鼠的MDA含量均显著降低，其中归芪多糖高剂量组下降呈显著差异(P<0.05),归芪多糖低剂量组下降呈极显著差异(P<0.01)，提示归芪多糖低剂量组效果更好。阳性药物组与归芪多糖高剂量组和低剂量组比较无显著性差异，提示归芪多糖与维生素E具有同等的降低肾组织MDA含量的作用。

衰老模型组与正常对照组相比，蛋白羰基含量显著升高(P<0.05)，表明自由基攻击蛋白质造成机体的氧化损伤，使蛋白质羰基含量升高；经归芪多糖及维生素E保护后，阳性对照组与给药组的羰基蛋白含量含量均降低，其中阳性对照组与归芪多糖低剂量组下降更显著(P<0.05)，但各给药组间相比无统计学意义，表明归芪多糖与维生素E具有同等的抑制肾组织蛋白质羰基化的作用，且归芪多糖低剂量组优于高剂量组。

表1 归芪多糖对衰老大鼠肾组织MDA、蛋白羰基含量的影响±s)

注：与衰老模型组相比，*P<0.05,**P<0.01

2.3 归芪多糖对衰老大鼠肾组织SOD、GSH-PX活力和GSH含量的影响

从表2可以看出，衰老模型组与正常对照组相比，SOD活力显著降低(P<0.01)，表明衰老大鼠体内SOD清除氧自由基的能力衰弱，从而导致肾组织受氧化损伤严重。经归芪多糖及维生素E保护后，阳性对照组与给药组的SOD活力均显著升高(P<0.01)，增强肾组织清除自由基的能力，从而达到抗衰老防氧化的作用，其中归芪多糖低剂量组的效果更好。阳性药物组与归芪多糖高剂量组和低剂量组比较无显著性差异，提示归芪多糖与维生素E具有同等的增强SOD清除氧自由基能力的作用。

衰老模型组与正常对照组相比，GSH-PX活力显著降低(P<0.01)。经归芪多糖及维生素E干预后，阳性对照组与给药组的GSH-PX活力均升高，其中归芪多糖高剂量组和低剂量组升高呈显著性差异(P<0.05)。阳性药物组与归芪多糖高剂量组和低剂量组相比无显著性差异，提示归芪多糖与维生素E具有同等的降低GSH-PX活力的作用，且归芪多糖低剂量组优于高剂量组。

衰老模型组与正常对照组相比，GSH含量显著降低(P<0.01)；经归芪多糖及维生素E保护后，阳性对照组与归芪多糖高剂量组的GSH含量升高呈显著性差异(P<0.05)，归芪多糖低剂量组升高呈极显著性差异(P<0.01)，提示归芪多糖低剂量组的效果更好，但各给药组间无显著性差异，表明归芪多糖和维生素E具有同等的降低GSH含量的作用。

表2 归芪多糖对衰老大鼠肾组织SOD、GSH-PX活力和GSH含量的影响±s)

注：与衰老模型组相比,*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

在抗衰老的科学研究中，建立恰当衰老动物模型是成功实验的基础。目前用于衰老机制研究的动物主要采用自然衰老动物或人为致衰的动物， 后者因其具有个体差异小， 实验周期短，节省人力物力等优点广泛用于衰老机制、抗衰老药物筛选方面的研究。本实验采用D-gal制作衰老模型，结果显示，模型组在注射D-半乳糖42 d后，大鼠肾组织MDA、蛋白羰基含量升高，SOD、GSH-PX活力、GSH含量下降。说明D-半乳糖致衰老大鼠的指标与自然衰老时大鼠的免疫指标基本一致。因此，D-半乳糖致亚急性衰老模型是可行的[13]。

丙二醛(MDA)是氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用形成的产物，可间接地反映机体细胞受自由基攻击的严重程度，即细胞受损程度。它可以作为交联剂与多种生物大分子发生交联，被交联的物质丧失其生物活性。因此，MDA可以作为评价衰老的指标之一，测定MDA水平变化能较好地反映脂质过氧化水平[14]。

自由基过量产生可引起不同程度的细胞毒性及瞬时的不可逆损伤，抗氧化防御系统能防止氧及代谢产物的毒性反应，维持其平衡，是决定细胞生存状态的重要因素。机体防御体系包括抗氧化酶类如SOD、GSH-PX等；非酶类抗氧化物质如VC、VE、GSH等。这个防御体系的抗氧化能力的强弱与健康程度存在着密切联系。超氧化物歧化酶(SOD)广泛分布于各种生物体内，是目前为止发现的唯一以自由基为底物的酶，能将 O2-歧化为 H2O2和 O2,是机体内对抗自由基的第一道防线。且可与 GSH-Px 协同作用防止脂质过氧化及其代谢产物对机体的损害。因此其活力与含量反应了机体清除自由基的能力[15]。

GSH-Px是一种含硒的广泛存在于细胞线粒体、胞浆内以及生物膜上的水溶性四聚体蛋白酶，可通过特异性催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，对由活性氧和羟自由基诱发的脂质过氧化物及过氧化氢有极强的清除能力, 从而保护细胞免受自由基损害。随增龄，体内自由基增多，GSH-Px 的活性降低,因此可作为评价组织细胞衰老的又一个重要指标[16]。

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是一种低分子清除剂，它可清除O2-和H2O2，是组织中重要蛋白的巯基化合物。GSH分子中的巯基容易失氢而氧化，因而消除体内的活性氧，具有保护酶和蛋白质免受氧化、脏器免受损伤的功效[17]。

蛋白质羰基的产生是蛋白质分子被自由基氧化修饰的一个重要标记，可判断蛋白质是否受到氧化损伤。羰基类化合物主要从非酶糖基化、脂质过氧化以及氨基酸的代谢中产生，是非酶糖基化和脂质过氧化的共同中间产物，它们是造成蛋白修饰的直接原因之一[18]。

本实验研究表明，衰老模型组大鼠肾组织MDA含量、蛋白质羰基含量较正常对照组均显著升高，SOD、GSH-PX、GSH活力较正常对照组呈现明显的下降趋势，表明衰老大鼠肾组织受自由基攻击损伤，脂质过氧化物的含量增大，抗氧化酶活性降低，导致肾组织氧化损伤。灌服不同剂量的归芪多糖后，肾组织中MDA和蛋白质羰基含量均有不同程度的降低，SOD、GSH-PX、GSH活力均有不同程度的升高。其可能机制为：①归芪多糖通过提高机体抗氧化防御体系能力，增强对自由基的清除能力，并能抑制自发或由羟自由基引发的脂质过氧化反应；②归芪多糖可提高机体内抗氧化关键酶如SOD、GSH-PX的活性，上调抗氧化关键酶的表达，从而提高了清除自由基的能力，抗氧化活性增加；③归芪多糖可保护体内还原型物质，如GSH，从而增强抗氧化活性。阳性药物组与归芪多糖高、低剂量组相比无显著性差异，说明归芪多糖与维生素E具有相同的保护衰老大鼠肾组织氧化损伤的作用，且低剂量组优于高剂量组，可能的原因是低剂量归芪多糖与适量的黄酮类化合物和黄芪甲苷之间产生了协同保护肾组织的作用。

4 结论

在归芪多糖对衰老大鼠肾组织氧化损伤作用的研究中，不同剂量的归芪多糖可增强衰老大鼠肾组织中的SOD、GSH-PX活力和GSH含量，显著降低MDA和蛋白质羰基含量。此结果提示，归芪多糖可保护D-半乳糖所致大鼠肾组织的氧化损伤，从而起到保护肾脏衰老的作用，它可能是通过提高抗氧化酶及非酶类抗氧化物质的活性和抑制脂质过氧化物的产生，使肾组织代谢维持正常并减少了自由基对其的氧化损伤，这为进一步研究抗衰老的药物提供了有力的科学依据。

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Effect of Guiqi Polysaccharide on Oxidative Damageof Kidney Tissue in Aging Rats

PU Xiu-ying, LI Hai-bing, LI Xiao-yue, MA Xiao-long, LIU Lu, REN Jing

(CollegeofLifeScienceandEngineering,LanzhouUniversityofTechnologyTheKeyLabofScreening,EvaluationandAdvancedProcessingofTCMandTibetanMedicine,GansuEducationalDepartment,Lanzhou730050,China)

Objective: To study the effect of Guiqi polysaccharide on oxidative damage of kidney tissue in D- galactose-induced aging rats. Methods: We extracted polysaccharide from a percentage of angelica and astragalus membranaceus through the water extraction and alcohol precipitation method, and determined the content of polysaccharide with phenol sulfuric acid method. D-galactose was subcutaneous injected at a dose of 0.15 g/kg body weight every day except the normal control group. Rats of the low- and high-dose Guiqi polysaccharide (2.0 g/kg and 0.5 g/kg) were orally administrated daily for 42 days, respectively.Then superoxide dismutase (SOD ) activity,the content of glutathione peroxidase (GSH-PX), glutathione (GSH), malondialdehyde (MDA) content, protein carbonyl of kidney were determined, respectively. Results: Guiqi polysaccharides could enhance SOD, GSH-PX, GSH enzyme activity in renal tissue of aging rats,and it could significantly decrease the content of MDA and protein carbonyl . Conclusion: Guiqi polysaccharide can reduce free radical damage to the kidney of aging rats and protect the normal kidney from senescence.

Guiqi polysaccharide; Aging; SOD; GSH-PX; GSH; MDA; Protein carbonyl

2016-03-25

2016-09-12

国家自然科学基金项目(81260070)

蒲秀瑛(1967-)，女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向:临床前药理学和毒理学研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)02-0015-04