左归饮对D-半乳糖致亚急性衰老模型大鼠肝肾功能及其自由基代谢的影响

2017-04-25杨绍杰纪锐孙佳宝陈光伟黄树明杨书彬

中医药学报 2017年2期

关键词：半乳糖药组肝肾

杨绍杰，纪锐，孙佳宝，陈光伟，黄树明，杨书彬

(黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040)

方剂研究

左归饮对D-半乳糖致亚急性衰老模型大鼠肝肾功能及其自由基代谢的影响

杨绍杰，纪锐，孙佳宝，陈光伟，黄树明，杨书彬*

(黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040)

目的：研究滋阴补肾方左归饮对D-半乳糖致亚急性衰老模型大鼠肝肾功能及自由基代谢水平的影响，初步探索其抗衰老作用机制。方法：取健康SD大鼠72只，雌雄各半，随机分为六组，即对照组，模型组，维生素E组，左归饮高、低剂量组及六味地黄丸组。除对照组颈背部皮下注射生理盐水外，其余各组颈背部皮下分别连续注射D-半乳糖造成亚急性衰老模型。造模同时，各给药组分别灌胃给予维生素E、高、低剂量左归饮及六味地黄丸药液进行干预，对照组与模型组同时分别给予等体积的蒸馏水。连续给药8周后，腹主动脉采血，取大鼠肝、肾组织，测定血清中肝肾功能主要指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)，以及肝肾组织中超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)水平。结果：与模型组比较，左归饮给药组能够降低大鼠血清中ALT、AST、ALP、CREA及BUN的含量，提高大鼠肝、肾组织中SOD 和T-AOC的活性，降低MDA的含量。结论：左归饮可能通过改善衰老大鼠的肝肾功能，影响肝肾自由基代谢水平而起到延缓衰老的作用。

左归饮；抗衰老；肝肾功能

现代医学研究表明，衰老源于自由基对细胞的损伤，体内自由基会剥夺细胞内分子外围的电子，为其未成对电子配对达到稳定状态，被剥夺电子的分子变成新的自由基，并继续剥夺其他分子的电子，发生链式反应，对包含该分子的细胞产生损害[1]。中医认为衰老与肝肾有关，“肝肾同源”即表达肝中所藏之血与肾中所藏之精可相互转化，肝血充盈则肾精足，肾精充沛则肝血旺，若肝血不足可致肾虚，反之亦然，肝肾亏虚表现出来的发堕齿落，爪甲无光，筋不能动，目始不明，正是衰老的一系列体征[2]。左归饮为《景岳全书》中记载的滋阴补肾名方，方中药物有熟地黄、山茱萸、枸杞子、山药、茯苓和炙甘草，中医常用以治疗腰酸遗泄，盗汗，口燥咽干等真阴不足证[3]，现代研究发现，左归饮具有延缓衰老作用[4-5]。本实验采用D-半乳糖复制大鼠衰老模型，同时采用左归饮进行干预治疗，观察其对实验大鼠的肝肾功能及自由基代谢水平的影响，试图阐明左归饮保护肝肾的抗衰老作用机制，进而为中医药延缓衰老机制的深入研究提供科学依据。

1 材料

1.1 实验动物

12月龄健康SD大鼠，雌雄各半，体质量(200±20)g，黑龙江中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(黑)2013-004。

1.2 药物与试剂

熟地黄、山茱萸、枸杞子、山药、茯苓和炙甘草(均购于安国市弘发中药材饮片有限公司，经黑龙江中医药大学杨书彬副教授鉴定为正品)；六味地黄丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂)；D-半乳糖(Sigma公司)；维生素E(青岛双鲸药业有限公司)；生理盐水(哈尔滨三联药业股份有限公司)；SOD、MDA、T-AOC试剂盒(南京建成生物工程研究所)；ALT、AST、ALP、BUN、CREA试剂盒(北京利德曼生化股份有限公司)。

1.3 仪器

T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；ME155DU电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);L600型台式低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);全自动生化分析仪(日立公司)。

2 方法

2.1 药物制备

按左归饮处方比例称量药材，以10倍量蒸馏水浸泡，时间30 min，煎煮至沸腾，并保持微沸40 min，8层纱布过滤，得滤液；再以8倍量蒸馏水煎煮至沸，并保持微沸20 min，依上法过滤，与前次所得滤液合并，浓缩至含生药量0.1 g/mL，冻干得粉，备用。六味地黄丸以蒸馏水研磨，得0.04 g/mL药液。D-半乳糖以生理盐水溶成50 mg/mL注射用药。

2.2 模型建立及给药

取健康SD大鼠72只，雌雄均半，随机分六组，即对照组，模型组，给药组(维生素E组，左归饮高、低剂量组，六味地黄丸组)。除对照组颈背部皮下注射生理盐水外，其余各组颈背部皮下注射D-半乳糖复制亚急性衰老模型，剂量为125 mg/(kg·d)。造模同时，各组灌胃给药，维生素E组给予维生素E 10 mg/(kg·d)，左归饮高、低剂量组分别给予左归饮药液2.4 g/(kg·d)和1.2 g/(kg·d)，六味地黄丸组给予六味地黄丸药液0.4 g/(kg·d)，对照组与模型组给予蒸馏水，连续8周。

2.3 取材及处理

末次给药24 h后，根据大鼠体质量，以10%水合氯醛腹腔注射将其完全麻醉，腹主动脉采集血液，室温下放置2 h，3 000 r/min离心，时间10 min，收集离心所得血清，用于肝肾功能指标检测；取肝、肾组织，于冰冷生理盐水中漂洗去组织表面血液，滤纸吸干，称重，加入适量生理盐水，在冰水浴中机械匀浆，最终制得10%肝、肾组织匀浆，将制备好的组织匀浆在2 000 r/min条件下离心15 min，取上清匀浆液，用于自由基代谢指标检测。

2.4 指标测定

采用全自动生化分析仪对血清进行ALT、AST、ALP、CREA及BUN各指标检测；按照试剂盒说明书要求，对肝、肾组织匀浆中的SOD、T-AOC及MDA各指标水平进行测定。

2.5 数据处理

3 结果

3.1 对大鼠血清中ALT、AST、ALP、CREA及BUN的影响

结果见表1。与对照组比较，模型组除ALT略有降低外，其余各项指标水平均有明显增加，其中ALP、BUN、CREA具有统计学意义；与模型组比较，各给药组对所有指标水平均有回调趋势，其中各给药组中BUN，维生素E组及左归饮低剂量组中AST，维生素E组、左归饮高剂量组及六味地黄丸组中ALP和CREA，具有统计学意义。

表1 对大鼠血清中ALT、AST、ALP、CREA及BUN的影响

注：与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;与对照组比较，△P<0.05,△△P<0.01

3.2 对大鼠肝组织中SOD、T-AOC及MDA的影响

结果见表2。与对照组比较，模型组肝脏组织SOD 和T-AOC活性显著降低，MDA含量显著升高，且具有统计学意义；与模型组比较，各给药组肝脏组织SOD 和T-AOC活性显著升高，MDA含量显著降低，均有统计学意义。

3.3 对大鼠肾脏组织中SOD、T-AOC及MDA的影响

表2 对大鼠肝组织中SOD、MDA及T-AOC的影响

注：与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;与对照组比较，△P<0.05,△△P<0.01

结果见表3。与对照组比较，模型组大鼠肾脏组织中SOD 和T-AOC的活性显著降低，MDA含量显著升高，具有统计学意义；与模型组比较，各给药组大鼠肾脏组织中SOD 和T-AOC的活性均显著升高，MDA的含量明显降低，除左归饮低剂量组MDA的含量无统计学意义外，其余各组均有统计学意义。

表3 对大鼠肾组织中SOD、MDA及T-AOC的影响

注：与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;与对照组比较，△P<0.05,△△P<0.01

4 讨论

研究表明，衰老小鼠的肝肾会出现组织结构退行性病变，组织细胞超微结构的不同程度损伤[6-7]。当肝肾组织出现组织结构的退行性病变时，其代谢水平和生理功能都会受到一定程度的影响。ALT、AST、ALP、BUN及CREA是评价肝肾脏功能的重要指标，当肝肾组织出现损伤或者病变时，其对应的功能指标水平也将出现不同程度的变化[8]。本实验结果表明，左归饮对衰老大鼠肝肾功能指标水平均有回调作用，尤其对BUN、AST、ALP和CREA指标作用明显，说明左归饮具有改善肝肾功能的作用。在衰老的几大学说中，学者们普遍认可的是1956年Harman D提出的自由基学说，该学说指出，正常情况下，机体内的自由基可被抗氧化酶类清除，不对细胞造成损伤。当机体内的抗氧化酶类减少或活性降低时，体内的自由基数量增加，此时过多的自由基就会造成体内DNA、蛋白质及脂类的损伤，影响机体正常功能，从而导致衰老[6]。SOD是机体内一种重要的抗氧化酶，能够清除多余的超氧阴离子自由基[7-9]，T-AOC是体内多种抗氧化物抗氧化能力的总和，MDA是体内脂质过氧化反应的产物[10]，三者均为现代研究抗氧化和抗衰老重要检测指标。本实验结果表明，左归饮通过升高大鼠肝肾组织中SOD、T-AOC活性水平，降低MDA含量的作用，发挥延缓衰老作用。中医理论认为，人的衰老跟五脏的虚衰有着紧密联系，《黄帝内经》记载：“五十岁，肝气始衰，肝叶始薄，胆汁始灭，目始不明；六十岁，心气始衰，苦忧悲，血气懈堕，故好卧；七十岁，脾气虚，皮肤枯；八十岁，肺气衰，魄离，故言善误；九十岁，肾气焦，四脏经脉空虚；百岁，五脏皆虚，神气皆去，形骸独居而终矣。”[11]可见，人之衰老，始于五脏，五脏虚衰，以肝为先[12]，至肾而终。中医又有“肝肾同源”的重要理论。因此，中药抗衰老可从补益肝肾的途径，绝肝气始衰，延肾气之寿。左归饮方中重用熟地黄，滋肾填阴，山茱萸、枸杞子辅之养肝血，茯苓、炙甘草佐之益气健脾，山药益阴健脾滋肾，诸药合用有滋肾养肝益脾功效[13]。

综上所述，左归饮可以通过改善衰老大鼠肝肾功能，提高肝肾组织自由基代谢水平，发挥抗衰老作用，也为其抗衰老作用及机制的深入研究提供实验依据。

[1] Hekimi S,Wen Y.Taking a“good” looking at free redicals in the aging process[J].Trends in Cell Biology,2011,21(10):569-576.

[2] 马列光，马方励，胡明华，等.中医五脏衰老时象的认识与文献源流[J].环球中医药，2015,8(7):819-822

[3] 刘宏,贾彦,仲丽丽,等.左归丸对惊恐伤肾MCAO大鼠BDNF及其受体的影响[J].中医药信息,2015,32(4):10-14.

[4] 王燕. 左归饮对衰老模型小鼠血清SOD GSH - Px MDA 及 IL - 2的影响[J]. 中华中医药学刊, 2009,27(7):1503-1504.

[5] 赵薇，温海霞，郑慧丽，等. 左归饮对围绝经期大鼠卵巢VEGF及SPARC表达的影响[J]. 中国中药杂志, 2009,34(22):2932-2936.

[6] 耿广琴，李能莲，刘卉，等. 党参水提物对D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、肾细胞DNA和组织结构的影响[J].中医研究，2015,28(12):63-66.

[7] 耿广琴，杨雅丽，王晶，等. 党参水提物对D-半乳糖致衰老模型小鼠肝肾SOD活性、MDA含量及超微结构的影响[J].中医研究，2014,27(7)：70-74.

[8] 斯琴,布日额.苦瓜提取物影响Ⅱ型糖尿病小鼠血清SOD、MDA的Meta分析[J].中医药信息,2015,32(1):17-20.

[9] 许荣生.桃红四物汤加味治疗黄褐斑的临床疗效及抗氧化作用机制研究[J].中医药信息,2015,32(4):100-102.

[10] 周凌辉，黄悦. 慢性肾病患者唾液尿素氮、肌酐、尿酸测定(附80例分析)[J].福建医药杂志，2007，29(3):115-117.

[11] 游庭活，温露，刘凡. 衰老机制及延缓衰老活性物质研究进展[J].天然产物研究与开发, 2015,27(11):1985-1990.